[发明专利]一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法

说明书

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒复制非必需基因插入突变，并获得表达外源基因的重组伪狂犬病毒的方法。本发明将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入细胞后，通过预先筛选的靶序列识别病毒基因组，对感染细胞的伪狂犬病毒基因进行编辑和重组。该方法构建的重组伪狂犬病毒在特定基因部位插入目的外源基因，而不影响病毒自身的复制，且构建过程中利用标记正向或反向筛选重组病毒，显著提高了重组病毒的获得效率，为构建表达外源基因的重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建的重组伪狂犬病毒的方法可用来快速构建重组病毒活载体疫苗，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科。病毒基因组为双链DNA，全长约150kb，编码约70种蛋白质。伪狂犬病毒的胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)等基因是伪狂犬病毒的复制非必需基因，同时也是病毒的重要毒力基因，这些基因的缺失能显著降低病毒毒力，且不影响伪狂犬病毒增殖和免疫原性。伪狂犬病毒遗传稳定性强，在非必需基因中插入外源抗原基因也不影响病毒的增殖，具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野生动物。伪狂犬病毒作为一种嗜神经病毒，在体内感染时优先感染神经系统，并能建立长期稳定的隐性感染。伪狂犬病毒的众多特性使其可以作为病毒活载体，为构建二价或多价基因工程活疫苗提供分子操作基础。

利用基因工程技术改造病毒基因组是构建重组病毒活载体疫苗的关键步骤。细菌人工染色体(BAC)系统是最常用于构建重组病毒的方法，前期需要将病毒基因组克隆到BAC质粒中。但这一克隆过程对于基因庞大的病毒(如疱疹病毒)来说费时、费力且成功率较低。CRISPR/Cas9系统是新近发展起来的基因编辑技术，将CRISPR/Cas9系统导入细胞后，通过对特定靶序列识别，可实现对感染细胞病毒基因组的高效率编辑和改造。与BAC系统相比，CRISPR/Cas9系统无需克隆亲本病毒基因组，该方法操作简单、编辑效率高、价格低廉、应用范围广泛，是一种构建重组病毒的高效方法。

发明内容

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因的重组病毒，本发明所要解决的技术问题是如何降低伪狂犬病毒的毒力，并在其增殖能力不受影响的情况下表达外源基因，为构建二价或多价基因工程疫苗提供分子操作基础。

本发明提供了一种构建重组伪狂犬病毒的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的活性、降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中TK的含量或/和降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中所述TK的表达量，并在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，得到重组伪狂犬病毒。

上述方法中，所述TK为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；

A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。

所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。

上述方法中，所得重组伪狂犬病毒的TK活性、含量或/和表达量低于所述目的伪狂犬病毒，并表达所述目的外源基因，且复制能力与所述目的伪狂犬病毒没有显著差异。