[发明专利]干细胞活性因子及其冻干粉剂

权利要求书

1.干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：包括如下步骤：

干细胞活性因子的提取：

提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；

当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；

当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；

细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；

将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；

（二）冻干粉剂的制备：

A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；

B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；

C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；

D、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；

E、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。

2.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。

3.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4～6°C，500w，超声2～3秒，间隔8秒，86个循环。

4.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中脐带选取后，需要对其进行清洗，清洗后的脐带组织剪成4～5cm的小段，清洗一次，然后在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮，然后将华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎，然后将组织碎块转移至125～150ml储液瓶中，加入1～2倍体积的组织消化液，于37～40°C振荡培养箱中消化1.5～3小时，直至无成形组织块，进行细胞培养。

5.根据权利要求4所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。