[发明专利]一种体外制备环状DNA的方法

权利要求书

1.一种体外制备环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装连接片段，同时引入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点序列，所述的Gibson组装连接片段按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计，反向互补序列一并设计，所述的BsaⅠ识别位点为：

5’GGTCTCNNNNN3’，

5’CCAGAGNNNNN3’，其中N代表碱基A、T、C、G中任意一个，且N不必相同；

步骤2，合成Gibson组装连接片段；

步骤3，按照目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段的摩尔比为1：3进行混合，进行Gibson组装，回收产物；

步骤4，以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增，纯化得到RCA产物；

步骤5，对纯化的RCA产物进行BsaⅠ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带；

步骤6，将上述酶切产物利用T4 DNA连接酶进行环化，纯化，去除未环化的线性DNA片段，得到目的线性DNA片段的环化产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，选取20个组合作为NNNNN：

CACAT，CTGAG，TACAC，CGCCT，ACCCG，ACACA，CAGAA，ACCGT，ACCCA，TGCCG，TTTTA，CCAGA，CACCC，GTGGG，AGGTG，CCAAA，ATTGG，CTGAG，GACGG，GAATA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，采用滚环复制酶phi29进行滚环扩增。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述的RCA产物采用乙醇沉淀的方法纯化，具体为：在RCA反应液中加入3倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L、pH5.2的乙酸钠溶液，-20℃静止30min，剧烈震荡，然后在4℃、12000r/min下离心10min，去除上清液，风干，加入无菌水溶解。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6中，利用T5外切酶进行纯化。