[发明专利]一种体外制备环状DNA的方法

说明书

本发明公开了一种体外制备环状DNA的方法。所述方法先根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装连接片段，同时引入限制性内切酶Bsa Ⅰ的识别位点序列，然后将目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段混合，进行Gibson组装，再以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增，纯化得到RCA产物，之后对纯化的RCA产物进行Bsa Ⅰ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带，最后将酶切产物利用T4 DNA连接酶进行环化并纯化得到目的线性DNA片段的环化产物。本发明方法能够替代传统质粒，除必需元件外，仅额外引入长度为11个碱基的内切酶识别序列，将环状DNA分子量降到最低的同时降低生物安全风险，实现体外环化线性DNA片段。

技术领域

本发明属于DNA合成技术领域，涉及一种体外制备环状DNA的方法。

背景技术

质粒作为一种分子生物学工具，广泛用于基因表达、RNA转录、基因调控等领域。在质粒的应用过程中，涉及质粒构建、大肠杆菌感受态细胞转化实验、酵母细胞转化实验、动物细胞转染实验等。在真核细胞转染实验中，效率尤为关键。质粒进入真核细胞的效率直接决定了实验效果是否满足需求。真核细胞转染效率与多个因素有关，其中质粒的大小是关键因素之一，同等条件下较小的质粒更容易转染进入细胞。因此，在保留必需功能元件前提下，减小质粒的大小可以提高转染效率。

近年来，生物安全越发受到社会关注，在生命科学研究领域，生物安全问题需要着重考量。由于质粒构建过程需要借助原核生物大肠杆菌，这就导致质粒本身除了目的元件外，尚存在大量原核生物相关元件，这些原核生物相关元件对于真核细胞而言，一方面是冗余序列，增加了质粒大小，降低转染效率；另一方面是外源序列，是威胁生物安全的外源因素。

现有两种较成熟的技术可一定程度上解决上述问题。第一种是利用重组技术实现环状DNA(mcDNA)的制备，此技术在大肠杆菌体内，借助重组酶实现线性DNA片段的环化，同时冗余DNA序列被降解。第二种是利用聚合酶链式反应(PCR)技术对线性DNA片段大量扩增，扩增产物进行体外环化，得到线性DNA片段的环化产物。然而上述方法仍存在一定的缺陷，利用重组技术制备环状DNA，依然是在大肠杆菌细胞内进行的，且冗余序列的降解过程是有一定效率的，有不完全降解的可能，造成污染；利用PCR技术制备环状DNA，实现了体外制备，却需要进行96组PCR，过程复杂，成本较高。

参考文献：

1.Vítor Gaspar,Melo-Diogo D D,Costa E,et al.Minicircle DNA vectorsfor gene therapy:advances and applications[J].Expert Opinion on BiologicalTherapy,2015.

2.Cheng C,Tang N,Li J,et al.Bacteria-free minicircle DNA system togenerate integration-free CAR-T cells[J].Journal of Medical Genetics,2018.

发明内容

针对体外制备环状DNA方法中存在的残留污染和过程复杂、高成本的问题，本发明提供一种体外制备环状DNA的方法。

本发明的技术方案如下：

一种体外制备环状DNA的方法，包括以下步骤：

步骤1，根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装(Gibson Assembly)连接片段，同时引入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点序列，所述的Gibson组装连接片段按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计，反向互补序列一并设计，所述的BsaⅠ识别位点为：

5’GGTCTCNNNNN 3’，