[发明专利]一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平的报告载体及其应用，该报告载体含有第一启动子、第一报告基因、第二启动子和第二报告基因，所述第一报告基因的表达受第一启动子控制，所述第二报告基因的表达受第二启动子控制，所述第一报告基因和第二报告基因分别为lacZ基因和egfp，两者方向相反，表达互不干扰。利用本发明构建的报告载体可以对恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平进行检测，并且还能检测比较不同外界刺激对恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平的影响，操作简便快捷，结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用。

背景技术

环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的一种核酸类第二信使，参与调节多种生理活动，例如生物被膜状态和运动状态的转变、病原菌毒力、DNA复制和修复、细胞分化等。细菌通过响应胞外信号刺激来调节胞内c-di-GMP水平，进而改变下游代谢活动以适应当前环境。因此准确检测和比较细菌胞内c-di-GMP水平对于深入理解c-di-GMP在胞内的功能有重要意义。目前检测c-di-GMP的常用方法是质谱分析，主要过程为：抽提胞内c-di-GMP后通过质谱将其打碎成小片段，然后通过定量特异性片段的含量表征c-di-GMP水平，最后通过与c-di-GMP标准品比较，得出样品中的c-di-GMP浓度。质谱分析法直接、通用，是目前c-di-GMP研究中公认的最优方法，但质谱分析也存在一些缺点，例如抽提c-di-GMP的方法复杂，且用到一些有害的有机物试剂，大规模提取费时费力，对研究者身体健康也有损害；其次，用于质谱分析定量的仪器和c-di-GMP标准品价格昂贵，对于科研条件一般的实验室和需要大规模检测比较c-di-GMP水平的研究工作有局限性。

近年来，有研究者利用c-di-GMP调控的核糖开关或靶基因启动子构建c-di-GMP报告载体，用于在活体胞内检测c-di-GMP水平。通过检测报告基因(如荧光蛋白、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、半乳糖苷酶LacZ等)的表达确定细菌胞内c-di-GMP水平。这种方法操作简单，成本低廉，很适合大规模检测胞内c-di-GMP水平，而且可用于检测单个细胞的c-di-GMP水平，已被应用于多种细菌胞内c-di-GMP的检测。

目前使用的报告载体都只含有一个报告基因，即只通过一个报告基因的表达量表征胞内c-di-GMP水平，这种设计可能导致潜在的检测误差：首先，基因表达存在异质性，即同一基因在不同细胞中表达情况不同，当检测单个细胞c-di-GMP水平时，只使用含一个报告基因的报告载体可能因为基因表达异质性造成检测结果有较大误差；其次，细菌DNA复制过程中有一定概率发生突变，如果突变发生在报告基因或启动子区域，会造成报告基因表达混乱或失效，影响检测结果。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用，该报告载体含有两个报告基因(lacZ和egfp)，分别受lapA和bcs启动子控制，c-di-GMP通过受体FleQ直接调控lapA和bcs的表达，高c-di-GMP水平下lapA和bcs表达量上升，低c-di-GMP水平下lapA和bcs表达量下降，因此，本发明通过同时检测两种报告基因的表达量来判断恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平，以降低基因表达异质性和基因突变对检测结果造成的影响，能提高检测的准确性。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体，该报告载体含有第一启动子、第一报告基因、第二启动子和第二报告基因，所述第一报告基因的表达受第一启动子控制，所述第二报告基因的表达受第二启动子控制，第一报告基因和第二报告基因的方向相反。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述第一启动子为lapA基因启动子，所述第一报告基因为lacZ基因。