[发明专利]一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒

权利要求书

1.一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，其特征在于：包括三部分：针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒、针对外周血液的实时荧光PCR检测试剂盒和一个特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序；所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒检测的高风险miRNAs如下：miR-324-5p、miR-210-3p、miR-421、miR-21、miR-661、miR-106a、miR-27a、miR-346及miR- 423-3p。

2.一种权利要求1所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：

第一步，针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒：组织称重，加1ml TRizol/50mg试剂，混匀，冰上放置裂解5 min；

第二步：加氯仿 200μl/ml TRizol ，剧烈摇匀，使其呈乳浊液，静置5 min；

第三步：12000g, 4度离心, 15 min；

第四步：吸取上清至另一EP管，加入等体积预冷异丙醇，混匀；

第五步：2000 g, 4度离心, 15 min；

第六步：弃上清，加1 ml 75%乙醇，洗涤沉淀，7500g， 4度离心, 10 min；

第七步：吸净上清，晾干酒精；

第八步：加RNase-free water溶解RNA；

第九步：测定总RNA浓度；

第十步：取1 μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；

第十一步，针对外周血液的实时荧光定量PCR检测试剂盒：取新鲜的全血200-800ul，加入10倍体积的TRIzol，充分吹打混匀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

第十二步：每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿，静置3min，离心12000g，4℃，15min；

第十三步：将上层水相转移到1.5ml EP管中，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，离心12000g，4℃，10min，弃上清；

第十四步：加入1ml的75%乙醇，上下颠倒10次，离心7500g，4℃，10min，弃上清；

第十五步：室温下干燥5-10min（充分干燥不好溶解），加入40ul的RNase-free-water充分溶解RNA，可在60℃水浴锅中促溶10min；

第十六步：测定总RNA浓度；

第十七步：取1 μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；

第十八步：上述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测；

第十九步：特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序分析。

3.根据权利要求2所述的一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测。

4.根据权利要求3所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述上机检测，以内参的循环数作为对照，计算2^-△△CT，再进行统计学分析。

5.根据权利要求4所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序为根据对已有数据的临床前瞻性研究，依据统计数据中ROC曲线的曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）以及P值对高危miRNAs进行分级。

6.根据权利要求5所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述AUC越大，提示指标的诊断能力越好，而p值主要用于衡量一次错误发生的指标。