[发明专利]一种猪骨骼肌卫星细胞高效分离和纯化的方法

权利要求书

1.一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将猪骨骼肌肉组织块依次用II型胶原酶溶液和胰蛋白酶消化后过筛，固液分离得到沉淀物；

2）将步骤1）的沉淀物制成细胞悬液采用差速贴壁纯化培养，直到细胞密度达到70%及以上，用胰酶消化，用完全培养基终止消化离心，弃去上清液加入培养基重悬后进行传代培养；

3）骨骼肌卫星细胞的鉴定：对步骤2）中传代培养的骨骼肌卫星细胞进行PAX7和MyoD基因免疫荧光染色鉴定，显示都呈阳性表达，且与DAPI染色的的细胞核完全重叠表明分离的细胞为骨骼肌卫星细胞。

2.根据权利要求1所述的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤1）中的II型胶原酶用量为0.25U/mg肌肉组织。

3.根据权利要求1所述的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤1）的固液分离先采用的是孔径为100目~300目的细胞筛网过筛，收集滤液，再取上清800~1000r/min离心8~10min得到沉淀物。

4.根据权利要求1所述的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤2）中的差速贴壁纯化培养具体步骤为：将细胞悬液培养0.5-1h后的细胞瓶中的上清转移至新的培养瓶，接着每0.5h将上清转移一次，共转移三次，第三次转移在细胞瓶中培养48h后更换培养液。

5.根据权利要求1所述的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤2）中胰酶浓度为0.25%。

6.根据权利要求1所述的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤2）完全培养基为80%的DMEM高糖培养基+20%FBS。