[发明专利]一种猪骨骼肌卫星细胞高效分离和纯化的方法

说明书

本发明公开了一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：将猪骨骼肌肉组织块依次用II型胶原酶溶液和胰蛋白酶消化后过筛，固液分离得到沉淀物；将沉淀物制成细胞悬液采用差速贴壁纯化培养，直到细胞密度达到70%及以上，用胰酶消化，用完全培养基终止消化离心，弃去上清液加入培养基重悬后进行传代培养；骨骼肌卫星细胞的鉴定：对传代培养的骨骼肌卫星细胞进行PAX7和MyoD基因免疫荧光染色鉴定，显示都呈阳性表达，且与DAPI染色的的细胞核完全重叠表明分离的细胞为骨骼肌卫星细胞。本发明的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法操作简便、获得细胞数量多，而且细胞纯度高，为猪骨骼肌的生长发育研究提供材料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，关于一种猪骨骼肌卫星细胞的高效分离和纯化培养方法。

背景技术

猪肉是日常生活中最主要的消费肉类，猪的产肉率与骨骼肌生长发育紧密相关，骨骼肌卫星细胞成肌分化方面的研究需要纯度高的骨骼肌卫星细胞系。

根据已报道的分离培养方法如猪骨骼肌单根肌纤维移植方法《猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法》获得的卫星细胞的纯度低；按照公开报道的骨骼肌卫星细胞分离方法《一种动物肌卫星细胞的分离培养技术》分离骨骼肌细胞分离方法，获得的骨骼肌卫星细胞数量非常少，已有的公开的其他动物的骨骼肌卫星细胞分离的方法在上述操作获得的细胞数量少、细胞纯度低，不能满足骨骼肌分子调控机制的研究需要，一种高效、可重复的猪骨骼肌卫星细胞分离方法亟待建立。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是建立了一种操作简便、获得的细胞数量多、细胞纯度较高的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，为猪骨骼肌的生长发育研究提供材料。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：

1）将猪骨骼肌肉组织块依次用II型胶原酶溶液和胰蛋白酶消化后过筛，固液分离得到沉淀物；

2）将步骤1）的沉淀物制成细胞悬液采用差速贴壁纯化培养，直到细胞密度达到70%及以上，用胰酶消化，用完全培养基终止消化离心，弃去上清液加入培养基重悬后进行传代培养；

3）骨骼肌卫星细胞的鉴定：对步骤2）中传代培养的骨骼肌卫星细胞进行PAX7和MyoD基因免疫荧光染色鉴定，显示都呈阳性表达，且与DAPI染色的的细胞核完全重叠表明分离的细胞为骨骼肌卫星细胞。

其中，所述步骤1）中的II型胶原酶用量为0.25U/mg肌肉组织。

其中，所述步骤1）的固液分离先采用的是孔径为100目~300目的细胞筛网过筛，收集滤液，再取上清800-1000r/min离心8min得到沉淀物。

其中，所述步骤2）中的差速贴壁纯化培养具体步骤为：将细胞悬液培养0.5-1h后的细胞瓶中的上清转移至新的培养瓶，接着每0.5h将上清转移一次，共转移三次，第三次转移在细胞瓶中培养48h后更换培养液。

其中，所述步骤2）中胰蛋白酶的浓度为0.25% ，体积为所加入肌肉组织的1倍。

其中，所述步骤2）完全培养基为80%DMEM高糖培养基+20%FBS。

有益效果：相比于现有技术，本发明具备以下优点：本发明的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法操作简便、获得细胞数量多，而且细胞纯度高，为猪骨骼肌的生长发育研究提供材料。

附图说明

图1为使用《一种动物肌卫星细胞的分离培养技术》中方法进行原代培养的骨骼肌卫星细胞显微镜图；原代第三次转移后培养48h的肌卫星细胞；

图2为本发明实施例提供的原代培养的骨骼肌卫星细胞显微镜图，其中，A：原代第三次转移后培养48h的肌卫星细胞；B：原代第4天的卫星细胞；C：分离纯化后的原代卫星细胞；