[发明专利]一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法

权利要求书

1.一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法，其特征在于：该复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法的具体步骤如下：

S1：样品浓度筛选和细胞株筛选：

CCK-8法筛选复方丹参片作用细胞的合适药物质量浓度：选择实验细胞、细胞培养、复方丹参片供试样品的制备、细胞种板及给药；

RTCA筛选复方丹参片的特定依赖性细胞株：RTCA实验细胞培养、复方丹参片RTCA实验样品的制备、RTCA测定、特定依赖性细胞株的筛选；

S2：实时细胞电子分析方法学考察：

样品制备；

精密度实验、稳定性实验。

2.根据权利要求1所述的一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中选择的实验细胞为大鼠心肌细胞、人脐静脉内皮细胞、大鼠胸主动脉平滑肌细胞，所述细胞的培养方式为：

将复苏的人脐静脉内皮细胞置于饱和湿度的细胞培养箱中，用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下培养细胞至85％融合度时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜中观察，取对数生长期的细胞用于细胞实[；

将复苏的大鼠心肌细胞置于饱和湿度的细胞培养箱中，用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下培养细胞至85％融合度时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜中观察，取对数生长期的细胞用于细胞实验；

取体质量约220gSD大鼠，腹腔注射10％水合氯醛溶液(35mL/kg)，待大鼠麻醉后处死，迅速剪开胸腔并剪取大鼠胸主动脉组织，立即放入预冷的含PBS的DMEM培养基(含1×105U/L青链霉素)，并反复不断洗涤。用手术镊轻轻刮去血管外膜及血管内膜，将血管剪成1mm3左右的小块，分别均匀平铺于培养皿中，向培养皿中加入含20％FBS的培养液3～5mL，置于37℃、5％CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养，直至传代，取对数生长期的细胞用于细胞实验。

3.根据权利要求1所述的一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法，其特征在于：所述复方丹参片供试样品的制备方法如下：取复方丹参片，置于研钵内捣碎，取0.32g，精密称定，置于50mL量瓶内，加入pH6.8的PBS溶液，超声30min溶解，再加入pH6.8的PBS溶液定容至刻度，滤过不溶物质，4℃储存备用，取上述溶液稀释不同倍数配成0、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、6.400mg/mL的药液用于CCK-8实验。

4.根据权利要求1所述的一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法，其特征在于：所述复方丹参片RTCA实验样品的制备的具体步骤如下：取复方丹参片置于研钵内捣碎，取0.32g，精密称定，置于50mL量瓶内，加入pH6.8的PBS溶液，超声30min溶解，再加入pH6.8的PBS溶液定容至刻度，滤过不溶物质，4℃储存备用。取上述溶液稀释不同倍数配成0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6mg/mL的药液用于Huvec细胞和H9C2细胞实验，另取上述溶液稀释不同倍数配成0.5、1.0、2.0、4.0、4.5、5.0、6.0mg/mL的药液用于RA-VSMC细胞实验。

5.根据权利要求1所述的一种复方丹参片的细胞生物效应的筛选方法，其特征在于：所述RTCA测定具体步骤如下：

首先在细胞检测板中每个小孔加入50μL生长介质，再加入密度为2×104个/mL的特定细胞悬液100μL；

将此细胞检测板在室温下放置30min后，放到培养箱中连续培养；

24h后，当细胞数量稳定时，取Huvec细胞和H9C2细胞的细胞检测板，除对照组外，向每孔中加入配好的复方丹参片供试药液50μL，使小孔内的药液终质量浓度分别为0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6mg/mL，每个质量浓度设3个复孔，另取RA-VSMC细胞的细胞检测板，除对照组外，向每个孔中分别加入终质量浓度0.5、1.0、2.0、4.0、4.5、5.0、6.0mg/mL的复方丹参片供试样品50μL，每个质量浓度设3个复孔；

将加好样的检测板放入实时细胞电子分析仪中，检测72h，测出各药液作用于细胞后所产生的TCRPs曲线，筛选出对复方丹参片具有较好浓度依赖性响应的细胞株。