[发明专利]一种高活性转座酶及其应用

说明书

本发明属于分子生物学及生物医药领域，具体涉及一种高活性转座酶及其应用，该高活性转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该氨基酸序列的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，由该氨基酸序列为基础的高活性转座酶用于转座系统可显著提高转座子的基因转移活性，该高活性转座酶酶及编码该高活性酶的核苷酸序列可用于构建基因转移系统，制备或用作基因组研究、基因治疗、细胞治疗、或者多功能干细胞诱导和/或分化的药物、制剂或工具等。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药领域，具体涉及一种高活性转座酶及其应用。

背景技术

DNA转座子是一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置转座到另一个位置。PiggyBac(PB)转座子是从粉纹夜蛾(Trichoplusiani)TN368细胞系中分离的一种DNA转座子，可特异性的插入到“TTAA”把位点，借助转座酶，PiggyBac转座子可将目的基因从宿主精确切离，且不会使宿主染色体发生重拍。PB转座子没有潜在的病毒遗传毒性，可携带较长外源基因片段(最多150kb)，具有很强的改造型。由PB转座酶介导的转基因具有整合效率高、稳定整合、长期表达、单拷贝整合、插入位点可定位、操纵简便等特点，常运用在转基因小鼠生产、小鼠胚胎干细胞遗传学操作、基因诱变等基因操作、多能干细胞诱导等多个领域。

PB转座酶的转座活性在现有哺乳动物DNA转座子中是最高的，具有很广泛的运用前景。国内外已有许多研究将PB转座子系统作为一种基因编辑的方法，运用在多种生物中进行转基因和基因突变，包括昆虫细胞、原生生物、植物和脊椎动物。2003年，Tomita将人类III型胶原蛋白与增强型绿色荧光蛋白EGFP融合，使用PB转座子整合到家蚕蚕丝蛋白基因中，获得了能稳定表达人类胶原蛋白的转基因家蚕。2005年，Balu将人二氢叶酸还原酶(hDHFR)通过PB转座子系统将其插入虐原虫基因组中。2014年，Eric T获得了PB转座子能进行体内转座的稳定转基因株系。2005年，Sheng Ding通过PB转座子将外源基因片段高效导入体外培养的人类细胞和小鼠细胞株，并使其稳定表达，培育出性状稳定的转基因荧光小鼠，证明了PB转座子系统可作为一种有效的操作工具用于研究其他脊椎动物基因功能的可能性。

DNA转座子系统由两部分组成，两端带有反向重复序列(IRs)可携带目的DNA片段的转座子和能催化转座子发生“剪切和粘贴”的转座酶。转座酶首先结合转座子两侧的IRs序列，然后将转座子从宿主DNA位点精准地无痕移除，最终将DNA片段整合到新的位点上。高效转座系统的建立可以实现对靶基因的定点敲除或者目的基因的定点引入，为哺乳细胞内的基因编辑提供有效的载体工具。转座系统的转座效率决定了基因编辑的效率，而转座效率很大一部分取决于转座酶的表达水平，因此，增加转座酶活性是增加转座子转座效率的关键技术点。

转座酶的转座活性受结合位点、活性位点及结构等因素的影响，目前尚未对转座酶的晶体结构作出清晰的解析，但有部分结构域被认为是重要结构，且实验证明转座酶的活性可由任何一个非特殊氨基酸影响。

一种用于哺乳动物的高活性PiggyBac转移酶(A hyperactive piggyBactransposase for mammalian applications,PNAS|January 25,2011|vol.108|no.4|1531–1536)公开一种转座效率为mPBase(经哺乳动物密码子优化的野生型PiggyBac转移酶)10倍的进行以下位点氨基酸突变的高活性PiggyBac转移酶(指下述现有高活性转座酶hyPBase，如SEQ ID NO:1所示)：I30V、G165S、S103P、M282V、S509G、N570S和N538K。