[发明专利]一种活性增强型NK细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将外周血单个核细胞与饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有细胞因子组合物的培养基培养，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞进行第二次共培养，得到活性增强型NK细胞。本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，按照特定顺序添加饲养细胞或细胞因子组合物，制备得到高纯度、高数量、具有显著提高的细胞杀伤能力的NK细胞，在细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种活性增强型NK细胞的制备方法。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)又称大颗粒性淋巴细胞，与γδT细胞和NKT细胞共同发挥固有免疫和获得性免疫功能。一方面，当机体发生感染或创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的方式快速、广泛、特异识别抗原，及时清除病原微生物和变异细胞，发挥固有免疫作用；另一方面，NK细胞参与适应性免疫应答，影响αβT细胞和B细胞的效应功能。

近年来细胞免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力，被认为是最有希望攻克癌症的方法，其中，基于NK细胞的免疫治疗技术受到了越来越多的关注。目前，制约NK细胞临床应用的主要障碍在于难以获得数量充足的NK细胞，在体外实现NK细胞的大规模扩增是NK细胞治疗要解决的关键问题。外周血中NK细胞数量少，而肿瘤病人的外周血中NK细胞的数量和活性明显下降，不同人的NK细胞的性质有很大差别。将基于NK细胞的免疫治疗技术应用于临床，对NK细胞的数量要求高。

现有技术存在着扩增后的NK细胞寿命短、活性不足等问题。因此，寻找更高效的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法采用饲养细胞和细胞因子相结合的方式培养NK细胞，提高了体外扩增后NK细胞的数量和活性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将外周血单个核细胞与饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；

(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有细胞因子组合物的培养基培养，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；

(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞进行第二次共培养，得到活性增强型NK细胞。

本发明中，采用饲养细胞和细胞因子相结合的方式培养NK细胞，短期内提高了NK细胞的扩增倍数，增强了NK细胞的扩增能力、纯度和扩增后细胞状态，有利于应用于细胞免疫治疗领域。

优选地，步骤(1)所述饲养细胞包括Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞。

优选地，步骤(1)所述饲养细胞经γ射线处理。

优选地，所述γ射线的强度为100～200Gy，例如可以是100Gy、110Gy、120Gy、130Gy、140Gy、150Gy、160Gy、170Gy、180Gy、190Gy或200Gy。

优选地，步骤(1)所述外周血单个核细胞与饲养细胞的细胞数比例为1:(1～10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。