[发明专利]一种等温核酸扩增方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种等温核酸扩增方法及应用，提供一种用于等温核酸扩增的重组酶组合物、包括所述的重组酶组合物的等温核酸扩增体系、一种用于等温核酸扩增试剂盒及相关应用。所述重组酶组合物由UvsX蛋白、UvsY蛋白和GP32蛋白组成；所述UvsX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述UvsY蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述GP32蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。采用上述重组酶组合物进行等温核酸扩增解决了现有技术中的RPA和RAA技术的最佳的扩增产物为500bp以内，对于对长片段扩增效果不佳，限制了其进一步的应用缺陷。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来自埃希氏杆菌属RB69病毒的三种酶在等温核酸扩增中应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外核酸扩增最常用的方法，自发明之日起，在生命科学研究等方面得到广泛应用。PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和延伸，通过不断重复该步骤，可以使少量的DNA片段得到指数级的扩增，从而达到可以检测的水平。PCR技术可以将少量核酸分子进行扩增，使目的DNA达到可以检测的水平，因此在多个领域被迅速应用，诸如疾病诊断、有害微生物检测、转基因检测等等。

但PCR也有自身一些弊端，PCR的每一个循环都包括变性、退火和延伸，因此，必须需要用精密的控温热循环仪器来实现，一般都是在实验室条件下完成，难以在床旁或户外应用，由于热循环仪器体积大，价格高使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。并且PCR的操作也相对复杂，需要专业人员来进行操作，也使应用受到一定的限制。为了解决PCR的这一局限性，等温核酸扩增技术悄然兴起，等温核酸扩增技术只需要一个恒定的温度，不受热循环仪器的制约，正逐渐成为PCR的最佳替代方法。

自二十世纪九十年代初以来，发展了很多等温核酸扩增方法，如链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)、环介导等温扩增(Loop MediatedIsothermal Amplification，LAMP)、解旋酶依赖等温扩增(Helicase DependentAmplification，HDA)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)等，这些方法的共同特点是扩增反应均在一个特定的温度下简单快速反应，从而大大的降低了对仪器的要求。但这些方法所扩增的产物多数和PCR扩增产物差异较大，从某种程度上也限制了其应用。而PCR经过几十年的发展，已经在各个领域有着广泛应用，如果扩增产物和PCR的扩增产物一样，都是双链DNA，无缝对接PCR核酸检测方法，将会极大的扩大等温核酸扩增的应用范围。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是最接近等温PCR的方法，其扩增产物也为双链DNA。国内也有类似的重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)，两者都是利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下进行核酸扩增的技术。RAA与RPA的区别在于RAA的重组酶的来源是细菌或真菌，而RPA是以T4噬菌体DNA复制机制为原理，两者的性能指标基本相似，目前已经在细菌和病毒的检测中广泛应用，但RPA和RAA技术的最佳的扩增产物为500bp以内，对于对长片段扩增效果不佳，限制了其进一步的应用。

本发明采用噬菌体RB69来源的相关蛋白，旨在扩增更长的片段，是恒温技术更广泛的应用在分子生物领域中，为表示和RPA和RAA的区别，本方法称为重组酶和聚合酶等温核酸检测(Recombinase And Polymerase Isothermal Detection,RAPID)方法，即RAPID方法。

发明内容