[发明专利]一种改良的MTHFR基因C677T位点多态性检测的样本处理方法

说明书

本发明提供了一种MTHFR基因C677T位点多态性检测的样本处理方法，包括以下步骤：(1)向待检测样本中加入裂解液，然后于68～75℃孵育4～6min；(2)向步骤(1)获得的产物中加入磁性微粒，混匀，磁性分离后弃上清；(3)对步骤(2)获得的磁性微粒进行洗涤，磁性分离后弃上清；(4)向步骤(3)获得的磁性微粒中加入洗脱液，混匀，然后于70～75℃孵育4～6min，磁性分离后收集上清；(5)取步骤(4)获得的上清进行PCR扩增，得到处理后的样本。所述处理方法经过样本裂解和PCR扩增条件等多参数进行优化，能有效提高检测结果的质量，避免检测线出现背景，同时缩短检测时间，提高检测效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改良的MTHFR基因C677T位点多态性检测的样本处理方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，MTHFR基因全长20.374kb，共有外显子12个，编码656个氨基酸残基组成的蛋白，主要功能是将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸是同型半胱氨酸(HCY)再次甲基化为蛋氨酸的甲基供体。MTHFR基因C677T位点多态性即677CC型(野生型)、677CT型(杂合突变型)及677TT(纯合突变型)。C677T位点的突变使酶对热不耐受从而活性降低，与CC型个体相比，CT型个体酶活性只有65％，而TT型个体酶活性仅有30％。同型半胱氨酸的再次甲基化受阻会使其不能甲基化为蛋氨酸而造成堆积，导致叶酸代谢水平降低及高同型半胱氨酸血症(HHCY)。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个代谢过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症，并被证实与出生缺陷密切相关，如唐氏综合征，唇腭裂，神经管缺陷等新生儿缺陷。

目前已有试剂盒可进行人外周血或人外周血提取的基因组DNA MTHFR基因C677T位点多态性的检测，为高同型半胱氨酸水平对叶酸代谢异常的患者提供辅助诊断及用药提供有效快速准确的临床参考，只有保证检测结果的准确性，才能为临床提供更有效的指导。现用试剂盒样本处理的方法大部分为手工操作，检测时间较长，且最终判断结果部分采用的是层析法，但检测线经常有背景，影响结果的判断，导致出现结果错判的现象。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种改良的MTHFR基因C677T位点多态性检测的样本处理方法，所述处理方法能有效提高检测结果的质量，避免检测线出现背景，同时缩短检测时间，提高检测效率。

具体技术方案为：

一种MTHFR基因C677T位点多态性检测的样本处理方法，包括以下步骤：

(1)向待检测样本中加入裂解液，然后于68～75℃孵育4～6min；

(2)向步骤(1)获得的产物中加入能吸附DNA的磁性微粒，混匀，磁性分离后弃上清；

(3)对步骤(2)获得的磁性微粒进行洗涤，磁性分离后弃上清；

(4)向步骤(3)获得的磁性微粒中加入洗脱液，混匀，然后于70～75℃孵育4～6min，磁性分离后收集上清，获得DNA溶液；

(5)取步骤(4)获得的DNA溶液进行PCR扩增，得到处理后的样本；扩增引物如下：针对MTHFR基因C677T位点突变型的扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ IDNO.2所示的下游引物；针对MTHFR基因C677T位点野生型的扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物；所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示引物上修饰有可检测的分子标记。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中于69～72℃孵育4～6min。