[发明专利]一种制备细胞外囊泡的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种制备细胞外囊泡的方法及其应用，包括建立细胞焦亡模型以诱导细胞发生焦亡；获取直径1～5μm且包含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶‑1的焦亡小体。本发明焦亡小体的制备方法操作便捷、生产成本低，所得焦亡小体纯度高、活性好、保存方便、毒副作用低，利于连续生产；同时应用途径广泛，不仅可作为检测损伤部位的特异性标记物，并且能够用于免疫疗法，将其作为肿瘤疫苗，从而实现癌症的精准靶向治疗，推进肿瘤疫苗或药物的开发。

技术领域

本发明属于细胞外囊泡制备技术领域，具体涉及一种制备细胞外囊泡的方法及其应用。

背景技术

细胞焦亡又称细胞炎性坏死，表现为细胞肿胀变圆、细胞膜破裂、炎症因子释放。近年来的研究证实，机体多种细胞均可发生焦亡，细胞焦亡会发生细胞核皱缩、外吐小泡形成焦亡小体。

细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用，然而目前关于细胞焦亡的应用与转化的研究仍然是缺乏的。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种制备细胞外囊泡的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种制备细胞外囊泡的方法，其包括，建立细胞焦亡模型以诱导细胞发生焦亡；获取直径2～5μm且包含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1的焦亡小体。

作为本发明所述的制备细胞外囊泡的方法的一种优选方案：所述建立细胞焦亡模型以诱导细胞发生焦亡，为采用脂多糖和尼日利亚菌素共培养细胞，其中，所述脂多糖浓度为0.5μg/ml～10μg/ml,所述尼日利亚菌素浓度为0.5μmol/L～20μmol/L。

作为本发明所述的制备细胞外囊泡的方法的一种优选方案：所述建立细胞焦亡模型以诱导细胞发生焦亡，为在培养环境为35℃～37℃，5％CO₂，20％O₂，当细胞密度融合至百分之八十以上时，加入脂多糖，培养5h后，加入尼日利亚菌素继续培养40～50min，诱导细胞发生焦亡，产生焦亡小体，收取细胞上清液。

作为本发明所述的制备细胞外囊泡的方法的一种优选方案：所述获取直径2～5μm且包含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1的焦亡小体，为在收取细胞上清液后，在离心力为300～700g下离心，离心时间为5～30min，弃掉上清液，收取沉淀；将所述沉淀用磷酸缓冲盐溶液重悬，在离心力为300～700g下离心，离心时间为5～30min，弃掉上清液，收取沉淀，得到所述焦亡小体。

作为本发明所述的制备细胞外囊泡的方法的一种优选方案：所述细胞，包括脐静脉内皮细胞、支气管上皮、血管内皮细胞、肺腺癌A549细胞。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的细胞外囊泡在制备检测机体损伤部位和损伤程度药物中的应用。

所述检测机体损伤部位和损伤程度，包括检测支气管上皮细胞和血管内皮细胞损伤程度。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的细胞外囊泡在制备肿瘤疫苗或抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤，包括肺腺癌。

本发明的有益效果：发明人通过对细胞焦亡形态学的反复验证，发现细胞焦亡过程中产生的外吐小泡，能保留细胞本身的膜特异性蛋白，并且会释放至细胞外介质中，相比于细胞正常生理状态下衍生的细胞外囊泡凋亡小体，本发明焦亡小体免疫原性更强，具有很好的免疫激活作用。本发明提供的细胞外囊泡焦亡小体的制备方法，获得的直径2～5μm焦亡小体保留了原细胞的膜特异性蛋白，能够作为判断机体具体损伤部位和损伤程度的依据；肿瘤细胞产生的焦亡小体，具有优良的抗肿瘤效果，可作为肿瘤疫苗用于预防或治疗肿瘤癌症。