[发明专利]鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白及其制备方法和应用。培养大肠杆菌菌株并提取其DNA，设计大肠杆菌外膜蛋白表面抗原区域(21～274aa)基因序列的引物对，以鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物和载体pET‑28a(+)连接并转化E.coli BL21感受态细胞中，采取IPTG诱导的方法，诱导大肠杆菌外膜蛋白rBamD表达。经过纯化最终得到重组的大肠杆菌外膜蛋白rBamD。该重组外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能够有效抵抗鸭疫里默氏杆菌病的感染，以及鸭疫里默氏杆菌所引起的疾病。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和基因工程领域，尤其涉及鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)，RA系革兰氏阴性短杆菌，无鞭毛及芽孢，不运动，可产生荚膜，可感染家鸭、鹅、火鸡、雉鸡等，是目前危害水禽养殖业的主要病原菌，广泛分布于世界各地的养鸭场，且感染后较难清除。RA感染途径多为呼吸道感染和皮肤伤口(特别是脚部皮肤)感染，引起一种急性或慢性败血性细菌性传染病，典型病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等。该病的感染率有时可高达90％以上，但由于各血清型之间的毒力存在较大差异，所以死亡率为5％～75％不等，急性型表现为急性败血症死亡，慢性型一般无明显症状，有些可表现为减重、产蛋量下降等。该病病死率最高可达90％，对水禽养殖业，尤其鸭和鹅的养殖造成重大损失。

随着抗生素的长期大量使用，大大加速了致病菌耐抗药性的进化。越来越多的耐药性菌株不断出现。研究表明，鸭疫里默氏杆菌基因组中抗药性基因的比重现在已大量增加，且多重耐药现象极其严重，目前已陷入抗生素大量使用-病原菌耐药性增强-加大使用抗生素-耐药性进一步增强的恶性循环中。同时，抗生素大量使用导致的抗生素残留问题也日益严重。抗生素滥用引起的耐药性问题及抗生素残留问题已经是一个全球性亟需解决的问题，改善动物养殖条件，接种疫苗预防病原菌是减少抗生素使用的有效途径。

RA具有多个血清型，目前已报到的有25个血清型，虽然部分疫苗对本血清型或本致病型菌株具有较好的免疫保护作用，但对其他菌株的交叉免疫保护作用较弱或者没有。鸭疫里默氏杆菌病的爆发往往是多种RA共同作用的结果，这给RA的防治带来很大的挑战。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，编码上述鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)以鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物为：

BamD F-BamHⅠ：5′-GGATCCTACGACCTAGCAATGAAA-3′，

BamD R-NotⅠ：5′-GCGGCCGCCTGTTCTACTAACTTTTCT-3′；

2)将步骤1)获得的PCR产物与克隆载体连接，转化，提取质粒并测序；

3)将步骤2)测序正确的质粒与表达载体酶切连接，得重组原核表达质粒；

4)将步骤3)提取的重组质粒转化到表达宿主菌诱导表达，得鸭疫里默氏杆菌BamD重组蛋白。

优选地，步骤2)中，与克隆载体pMD-19T simple vector连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α。