[发明专利]一种双酶介导级联信号放大的氨苄西林检测适体传感器

说明书

一种基于双酶介导级联信号放大的氨苄西林适体传感器，由以下步骤制备得到：使用bio‑AP、DNA1及H‑DNA相互杂交形成的双链DNA作为检测探针，在T4 DNA连接酶及核酸外切酶III的辅助下，得到完整的APH链；通过生物素‑亲和素的特异性结合，APH链被捕获到微孔板中，作为HCR引发链，导致发夹DNA H1和H2交叉打开，产生双链DNA聚合物，加入荧光染料SYBR Green I指示剂，当其嵌入到双链DNA中时产生明显的荧光。基于核酸适配体与目标物的特异性结合，通过荧光强度的改变实现了对氨苄西林检测。本方法灵敏度高，特异性好，准确性高，能应于被污染食品如牛奶中氨苄西林的检测。

技术领域

本发明属于生物传感及核酸检测技术领域，涉及食品中氨苄西林（AMP）的检测，具体涉及一种双酶介导级联信号放大的氨苄西林检测适体传感器。

背景技术

作为广谱β-内酰胺抗生素之一的氨苄青霉素，AMP在医药及细菌感染治疗领域得到了广泛的应用，具有低毒性，低成本和良好临床效果的优势。近年来，尽管AMP作为生长调节剂或抗感染药促进了畜牧和饲料加工业的快速发展，但动物和家畜中非法、过量地使用，直接导致抗真菌药物在人类和动物源食品生产过程中的污染和残留，引起的健康和安全问题日益突出，如：超敏反应的出现，细菌对个体的抵抗力和肠道菌群失衡等。因此，为了保障人们的健康，实现食品中AMP的高灵敏检测至关重要。

目前，用于AMP的常规检测策略，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、液相色谱串联质谱（HPLC-MS）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、比色法等存在着灵敏度及特异性较低，分析过程繁琐、昂贵的试剂以及对精密仪器和技术人员的依赖等缺陷。因此，急需建立一种食品中AMP的高灵敏及高选择性方法。

作为一种单链的DNA或RNA分子，核酸适配体可以通过范德华力、静电相互作用、氢键相互作用等结合相应的靶标，包括金属离子，小分子，大分子，病毒和细胞等。与抗体相比，具有合成/修饰更简单，成本更低，易于储存和更好的稳定性的优点。同时，目标物分子的存在可以使适体与其互补DNA分离，从而诱导信号变化以进行目标检测，因此，发明人使用核酸适配体作为生物识别元件，结合DNA信号放大技术，构建了一种核酸适配体传感器用于AMP的检测研究。

发明内容

本发明的目的在于，克服上述现有技术的缺陷，提供一种双酶介导级联信号放大的氨苄西林检测适体传感器，以检测食品中氨苄西林（AMP）的含量。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种双酶介导级联信号放大的氨苄西林检测适体传感器，该传感器由以下步骤制备得到：

A.特定DNA的生成：将如SEQ ID No:1所示的生物素标记的AMP核酸适配体、如SEQID No:2所示的载体DNA1及如SEQ ID No:3所示的杂交链式反应HCR引发链DNA杂交形成双链DNA检测探针；于双链DNA检测探针中加入梯度浓度的氨苄西林标准品，在T4 DNA连接酶和核酸外切酶III的辅助作用下得到完整的APH链；

B.特定DNA的捕获及HCR反应，即信号的放大及读出：将上述APH链加入到链霉亲和素包被的聚苯乙烯微孔板中，使APH链被捕获到微孔板中作为HCR引发链；于微孔板中加入发夹DNA1和发夹DNA2，由HCR引发链将发夹DNA1和发夹DNA2交叉打开，最后加入荧光染料SYBR Green I指示剂，根据不同的荧光强度建立氨苄西林检测标准曲线。

上述传感器制备过程中所需物质如下：

1）96孔聚苯乙烯微孔板，市购产品；

2）链霉亲和素，市购产品，浓度为10 mg/mL；

3）AMP 标准品，市购产品；

4）T4 DNA连接酶及核酸外切酶III（Exo III），市购产品，浓度均为100 U/mL；