[发明专利]影响MDK基因调节胶质瘤迁移和侵袭的分子机制及应用

权利要求书

1.影响MDK基因调节胶质瘤迁移和侵袭的分子机制及应用，包括以下步骤：

(1)Westernblot分析胶质瘤细胞系MDK表达

Westernblot分析的方法如下：

用兔抗人MDK抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解组织。将裂解物样品在8-12％SDS-PAGE凝胶上分离，随后转移到聚偏氟乙烯膜上，并在4℃下与初级抗体孵育过夜。然后与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育。通过ECL试剂盒检测结合抗体。

(2)慢病毒介导MDK过表达，方法如下：

使用pMSCV-IRES-GFP载体构建了标记MDK的表达质粒，并将该质粒或相应的空载体(NC)转染293T细胞。利用这些细胞的重组逆转录病毒多重感染感染A172细胞，获得稳定感染过表达MDK基因(MDK-OE)的细胞系或对照细胞系。

(3)慢病毒载体介导MDK基因敲除，方法如下：

根据引物设计原则，设计3个能够特异敲除MDK的引物，制备重组MDK-shRNA慢病毒和阴性对照(N C)慢病毒。在U87-MG细胞中感染敲除MDK基因(MDK-KD)的慢病毒载体，获得稳定感染敲除MDK表达的细胞系和对照细胞系。

(4)Transwell、Matrigel-Transwel检测干扰MDK基因表达对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响，方法如下：

细胞被镀在Transwell分析插入物的上室，在无血清RPMI1640培养基中加入Matrigel基质液，并将混合物加入下室，用FBS清洗。24小时后通过用无菌棉签擦洗插入物的顶层，去除剩余的细胞。用0.1％结晶紫染色底层侵入细胞1小时，用数字显微镜检查、计数和成像。对每个腔室的五个随机场中的细胞数进行计数和平均。

(5)通过Westernblot分析检测干扰MDK基因表达后的细胞系中P-PI3K，PI3K，Akt，p-ERK及vimentin，beta-catenin的表达水平。