[发明专利]酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒。该检测方法是样品经过氧化石墨烯脱色后，经过组胺‑N‑甲基转移酶、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、腺嘌呤核苷酶和核糖‑1‑脱氢酶的酶偶联反应，分光光度法在340nm处检测NADPH的生成量，从而准确定量样品中组胺的含量。基于该方法的试剂盒，检测操作简单、结果重现性好、加标回收率高、不需要大型仪器，可用于中小企业和基层实验室的检测。

技术领域

本发明涉及食品加工、生物化学、检测试剂领域，具体涉及的是一种酱油和醋中组胺的酶偶联分析检测技术，及其基于该技术开发的检测试剂盒。

背景技术

组胺是生物胺的一种，是生物体内组氨酸在脱羧酶作用下的产物。组胺普遍存在于酱油、醋、黄酒等发酵食品中。食品中的组胺残留容易引物食品安全问题，如口服8～40mg组胺会产生轻微中毒症状，超过40mg会产生中等中毒症状，超过100mg会产生严重中毒症状。因此，组胺是一类潜在的食品危害因子。食品中组胺的检测方法主要有分光光度法、酶联免疫法、电化学生物传感器法、薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法是目前应用最多的检测食品中组胺的方法。目前报道的分光光度法检测组胺，存在操作步骤多、测定结果不稳定、平行性差等缺点，而高效液相色谱法等方法需要用到大型仪器，操作也较为复杂，检测时间较长，不适合于中小企业和基层单位使用。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提出了一种基于多酶偶联的方法，用于检测酱油和醋等食品中的组胺，该方法操作简单、测定结果平行性好、稳定可靠，定量反应准确。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酱油和醋中组胺的测定方法，过程为：酱油和醋中的组胺经脱色后，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶作用生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸，后者再经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷。腺嘌呤核苷再经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH。利用NADP⁺和NADPH在340nm吸光度差异，可以定量NADPH的生成量，从而确定组胺的含量。

在一些具体实施方式中，本发明提供的组胺的测定方法具体包括如下步骤：取酱油或醋样品溶液到离心管中，加入氧化石墨烯，振荡混匀，离心收集上清液，为待测溶液；取待测溶液入试管中，加入蒸馏水，混匀；加入试剂1，混匀，再加入试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值；根据标准曲线和稀释倍数计算出样品中组胺含量；

其中，所述的试剂1与试剂2的体积比为1:1-2；所述试剂1为：10～100mmol/L缓冲液、10～50mmol/L MgCl₂、10～50mmol/L KCl、10～200mmol/L NaCl、1～50mmol/L S-腺苷甲硫氨酸、0.1～10mmol/L NADP⁺、0.1～200g/L保护剂；

所述的试剂2为：10～100mmol/L缓冲液、1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶

1～1000U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、1～1000U/L腺嘌呤核苷酶、1～1000U/L核糖-1-脱氢酶、0.1～200g/L保护剂。

在一些具体实施例中，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。

在一些具体实施例中，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。

在一些具体实施例中，酱油或醋样品中组胺的脱色方法是，取一定量的样品溶液，加入50～200mg氧化石墨烯，振荡混匀1～5min，离心(5000～10000r/min)5～10min，收集上清液，备用检测。