[发明专利]一种检测果蔬中诺如病毒的方法

说明书

本发明公开了一种检测果蔬中诺如病毒的方法，包括如下步骤：步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT‑(q)PCR检测。本发明提供的磁性探针可有效分离、富集果蔬中的微量诺如病毒，进而提高了诺如病毒的检测灵敏度，相比于传统的基于PEG(聚乙二醇)沉淀的检测方法灵敏度提高3个数量级。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测果蔬中诺如病毒的方法。

背景技术

诺如病毒是引起人急性非细菌肠胃炎的主要病原体之一。近几年来不论国内还是国外都经常爆发由诺如病毒引起的病例，尤其是在人员密集的学校、医院、游轮等。根据美国CDC网站最新数据显示(2020)，在世界范围内，每5例急性肠胃炎病中就有1例是因为诺如病毒引起的，每年由诺如病毒感染造成的急性肠胃炎病例约6.85亿例，其中，5岁以下的儿童感染病例大约为2亿例，其中约5万儿童病例丧生，尤其是在发展中国家更是深受其害。

虽然目前的RT-(q)PCR是检测诺如病毒的“金标准”，但是面对多种多样的果蔬样品，当直接使用RT-(q)PCR检测方法检测果蔬中的诺如病毒时，由于果蔬样品中的诺如病毒含量过低，即使RT-(q)PCR有强大的扩增能力，也依然会导致RT-(q)PCR检测方法无法精确的检测诺如病毒。基于诺如病毒的低剂量致病性，如何对果蔬中的诺如病毒进行高效的分离和富集，提高诺如病毒检测方法的灵敏度，受到了越来越多的关注。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是目前诺如病毒检测方法灵敏度低的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测果蔬中诺如病毒的方法，包括如下步骤：

步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；

步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；

步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT-(q)PCR检测；

其中，所述磁性探针包括羧基化硅包Fe₃O₄磁性粒子和猪胃粘膜蛋白，所述羧基化硅包Fe₃O₄磁性粒子和所述猪胃粘膜蛋白通过偶联剂共价结合。

进一步地，步骤1中，所述洗脱缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，包括0.01-1％曲拉通、10-50U果胶酶、0.01-0.1mol/L甘氨酸，pH为8-11。

进一步地，步骤1中，将所述果蔬样品和所述洗脱缓冲液混合20-60min。

进一步地，步骤2中，所述磁性探针通过包括如下步骤制备得到：

步骤2.1、将FeCl₃·6H₂O和FeSO₄·7H₂O溶解于去离子水中，在氮气保护下加入氨水，制备得到Fe₃O₄磁性纳米粒子；

步骤2.2、将环己烷、正己醇、曲拉通与水混合得到反相微乳液，并加入所述Fe₃O₄磁性纳米粒子，随后将氨水、TEOS依次加入到所述反相微乳液中，反应得到硅包Fe₃O₄磁性纳米粒子；

步骤2.3、将所述硅包Fe₃O₄磁性纳米粒子分散于甲苯中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下反应得到氨基化硅包Fe₃O₄磁性纳米粒子；