[发明专利]一种快速检测单个生物大分子活性的方法

说明书

本发明公开一种快速检测单个生物大分子活性的方法，使用PBS溶液配置辣根过氧化酶溶液S1，将PBS溶液和甘油混合，并向甘油/PBS混合溶液加入过氧化氢和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液作为酶催化底物溶液S2，并将S1和S2混合得到酶促反应溶液S3，先将S2以微小液滴喷到暗场显微镜基底材料上，再将S3以微小液滴喷到暗场显微镜相同基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录，对比S2和S3喷雾形成的同样大小液滴的暗场信号，并分析S3喷雾形成的液滴暗场信号和时间变化曲线，最终得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线和酶的活性。本发明具有简单便捷、易于检测且反应迅速等优点，可实现单个酶分子及其活力的快速且精准检测。

技术领域

本发明涉及暗场显微镜成像和生物大分子分析测试技术领域，特别涉及一种快速检测单个生物大分子活性的方法。

背景技术

在生命科学技术中，为了研究生物大分子(如蛋白质、酶、病毒、纳米药物)的活性，显微成像技术必不可少，其中以分子荧光技术为代表的光谱分析手段具有实时、原位、非侵入等优势，在生命分析技术领域中得到广泛应用。荧光分析需要对研究对象进行荧光标记，标记过程既繁琐又耗时，还会对研究对象造成不可避免的干扰。

为解决现有技术中，使用荧光标记存在的技术问题，通常会使用暗场显微镜和表面等离子体共振显微镜等免标记成像技术，其中暗场显微镜具有光学信号稳定、免标记、实时成像等优点，在生命科学领域以及纳米粒子分析中具有独特优势。

酶是一类极为重要的生物催化剂，其由活细胞产生且对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA，并且酶属于生物大分子，分子质量至少为一万以上，甚至可达百万，其中辣根过氧化物酶是典型例子。辣根过氧化物酶通常来源于辣根，是临床检验试剂中最常用的酶，具有稳定性好、分子量小、活性高、特异性强、容易分离提纯等优异特性，不但被广泛应用于多个生化检测项目，并且也被运用于免疫类(ELISA)试剂盒，因此对于辣根过氧化物酶含量或活性的测定，在分析化学、环境科学、临床化学、组织化学研究中具有重要意义。

目前关于辣根过氧化物酶的测定方法主要有伏安法、化学发光法、分光光度法和荧光法，其中使用伏安法测定辣根过氧化物酶的方法报道最多，并且灵敏度较高，典型的测定浓度范围在1*10^-13～1*10^-9g/mL，使用伏安法测定辣根过氧化物酶是基于催化H₂O₂氧化苯胺类化合物，生成能在电极上还原的电活性物质，通过测定氧化产物可间接测定辣根过氧化物酶的含量。而采用化学发光测定辣根过氧化物酶的方法也较为灵敏，其检测限可达6.6*10^-13g/亮点。而分光光度法虽然简便、易操作，但其灵敏度不高，精确性也不够好。而荧光法基于辣根过氧化物酶催化H₂O₂氧化邻苯二胺、香高草酸等还原性物质，生成能产生荧光物质，测定荧光产物的量可间接测定辣根过氧化物酶含量，但在荧光分析中，由于受到杂蛋白影响，使空白背景的荧光也较高，最终存在精确性不够好缺陷。另外现有技术的荧光法、化学发光法以及电化学对于辣根过氧化物酶进行检测，其检测的极限约为10^-15～10^-18g水平。

纳米粒子催化剂的催化性能与粒子的材料、表面形貌以及不同晶面的暴露都有关系，即使同一方法合成的单个纳米粒子，其催化性能往往由于表面缺陷、活性位点以及晶面的不同而表现出差异性。对于高效的生物催化剂酶而言，由于其空间结构、构象不同以及酶活力波动，同一种酶的单个酶活性也可能表现出差异性。细胞内的酶活性在生病期间和正常时期活性也是有明显差异，因此酶活性研究对于细胞生物学、生物体发病过程的理解和疾病的检测至关重要。除了纯粹的生物学功能外，酶通过高效的催化反应的能力来实现绿色化学，选择和使用合适的生物催化剂，可在温和条件下对塑料、染料等材料进行完全的生物降解，实现资源可再生利用。

发明内容