[发明专利]一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用在审
申请号: | 202010951341.2 | 申请日: | 2020-09-11 |
公开(公告)号: | CN112143778A | 公开(公告)日: | 2020-12-29 |
发明(设计)人: | 赵辉;陈晨 | 申请(专利权)人: | 昂凯生命科技(苏州)有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6806 | 分类号: | C12Q1/6806;C12Q1/6858 |
代理公司: | 苏州中合知识产权代理事务所(普通合伙) 32266 | 代理人: | 刘召民 |
地址: | 215000 江苏省苏州市高*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 血浆 游离 dna 提取 转化 合并 方法 及其 应用 | ||
1.一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,包括以下步骤:
1)裂解:向血浆中加入蛋白酶K和裂解缓冲液进行裂解,所述裂解缓冲液为SDS、EDTA和Tris-HCl的混合液;
2)转化:向步骤1)产物加入转化混合液,进行转化,所述转化混合液为氢氧化钠、对苯二酚和亚硫酸氢钠的混合液;
3)结合:向步骤2)混合液加入结合液及磁珠,室温静置后进行磁分离,所述结合液为盐酸胍、柠檬酸及异丙醇的混合液;
4)漂洗:将得到的磁珠用漂洗液进行漂洗;
5)干燥洗脱:漂洗后的磁珠经干燥后加入洗脱液,室温静置后进行磁分离,洗脱后的上清液为提取转化后的游离DNA。
2.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤1)所述血浆与所述裂解缓冲液的体积比为1:0.1-0.4;所述SDS在裂解缓冲液中的质量百分比浓度为1-5%,所述EDTA在裂解缓冲液中的摩尔浓度为10-100mM,所述Tris-HCl在裂解缓冲液中的摩尔浓度为50-150mM;所述血浆与蛋白酶K的体积比为5-15:1,所述蛋白酶K的浓度5-20mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤1)所述裂解的温度为50-70℃;所述裂解时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤2)所述转化混合液加入体积与步骤1)所得裂解产物的体积比为1:3-5;所述氢氧化钠在转化混合液中的摩尔浓度为50-100mM,所述对苯二酚在转化混合液中的摩尔浓度为0.5-2mM,所述亚硫酸氢钠在转化混合液中的摩尔浓度为5-10M。
5.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤2)所述转化在PCR程序:98℃8min,54℃60min下进行。
6.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤3)所述结合液与步骤2)所获得的液体的体积比为1:2-4;步骤3)所述盐酸胍在结合液中的摩尔浓度为5-10M,所述柠檬酸在结合液中的摩尔浓度为2-5M,所述异丙醇在结合液中的体积分数为20%-30%。
7.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤3)所述磁珠浓度为20-100mg/ml;所述磁珠与血浆的体积比为1-2:50;所述磁珠为超顺三氧化二铁制成的磁性颗粒,且表面包被有羟基修饰的二氧化硅。
8.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤3)和5)中,所述静置时间为5-15min,所述磁分离时间为3-5min。
9.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法,其特征在于,步骤4)所述漂洗液为质量百分比浓度为70-90%的乙醇,漂洗次数为1-3次;步骤5)所述洗脱液为Tris-HCl;所述Tris-HCl的摩尔浓度为8-15mM,pH为7-9;所述干燥为室温下干燥2-6min。
10.权利要求1-9任意一项所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法在甲基化检测中的应用,其特征在于,所述甲基化检测的去磺化处理采用PCR程序95℃,15min预变性替代。
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