[发明专利]一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用

权利要求书

1.一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，包括以下步骤：

1)裂解：向血浆中加入蛋白酶K和裂解缓冲液进行裂解，所述裂解缓冲液为SDS、EDTA和Tris-HCl的混合液；

2)转化：向步骤1)产物加入转化混合液，进行转化，所述转化混合液为氢氧化钠、对苯二酚和亚硫酸氢钠的混合液；

3)结合：向步骤2)混合液加入结合液及磁珠，室温静置后进行磁分离，所述结合液为盐酸胍、柠檬酸及异丙醇的混合液；

4)漂洗：将得到的磁珠用漂洗液进行漂洗；

5)干燥洗脱：漂洗后的磁珠经干燥后加入洗脱液，室温静置后进行磁分离，洗脱后的上清液为提取转化后的游离DNA。

2.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤1)所述血浆与所述裂解缓冲液的体积比为1:0.1-0.4；所述SDS在裂解缓冲液中的质量百分比浓度为1-5％，所述EDTA在裂解缓冲液中的摩尔浓度为10-100mM，所述Tris-HCl在裂解缓冲液中的摩尔浓度为50-150mM；所述血浆与蛋白酶K的体积比为5-15:1，所述蛋白酶K的浓度5-20mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤1)所述裂解的温度为50-70℃；所述裂解时间为10-30min。

4.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤2)所述转化混合液加入体积与步骤1)所得裂解产物的体积比为1：3-5；所述氢氧化钠在转化混合液中的摩尔浓度为50-100mM，所述对苯二酚在转化混合液中的摩尔浓度为0.5-2mM，所述亚硫酸氢钠在转化混合液中的摩尔浓度为5-10M。

5.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤2)所述转化在PCR程序：98℃8min，54℃60min下进行。

6.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤3)所述结合液与步骤2)所获得的液体的体积比为1：2-4；步骤3)所述盐酸胍在结合液中的摩尔浓度为5-10M，所述柠檬酸在结合液中的摩尔浓度为2-5M，所述异丙醇在结合液中的体积分数为20％-30％。

7.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤3)所述磁珠浓度为20-100mg/ml；所述磁珠与血浆的体积比为1-2:50；所述磁珠为超顺三氧化二铁制成的磁性颗粒，且表面包被有羟基修饰的二氧化硅。

8.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤3)和5)中，所述静置时间为5-15min，所述磁分离时间为3-5min。

9.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤4)所述漂洗液为质量百分比浓度为70-90％的乙醇，漂洗次数为1-3次；步骤5)所述洗脱液为Tris-HCl；所述Tris-HCl的摩尔浓度为8-15mM，pH为7-9；所述干燥为室温下干燥2-6min。

10.权利要求1-9任意一项所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法在甲基化检测中的应用，其特征在于，所述甲基化检测的去磺化处理采用PCR程序95℃，15min预变性替代。