[发明专利]一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用，所述方法包括如下步骤：裂解、转化、结合、漂洗、干燥和洗脱。本发明在血浆被裂解处理后就开始游离DNA的转化的过程，省略了传统游离DNA提取时结合与洗脱的步骤，减少样本损失；同时，游离DNA的提取和转化过程在同一个离心管内进行，进一步减少了样本转管时造成的损失。本发明还省略了传统DNA转化过程中的脱磺基步骤，转而由PCR检测时程序中的预变性步骤来代替，相比于传统方法更加简便、高效、降低成本并利于自动化操作，增加了血浆游离DNA甲基化检测的起始样本量，使检测敏感性进一步增加。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用。

背景技术

近年来以甲基化分析为代表的表观遗传学和表观基因组学研究较为活跃，尤其是对肿瘤抑制基因启动子CpG位点的DNA异常高甲基化研究已经成为热点。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到CpG位点的5＇胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶的过程。人类基因启动子区含有大量的CpG位点，当这些CpG位点发生异常高甲基化时，该基因的转录和表达就会受到抑制，最终引起疾病的发生。当含有异常高甲基化DNA的细胞死亡时，DNA进入血液循环系统。因此，以血液为样本检测异常DNA甲基化对于早期癌症的检测具有重要意义。

为了区分和检测正常样本和癌症样本中的甲基化序列，人们设计了多种方法。第一代方法主要是使用甲基化敏感限制性内切酶处理样本，然后进行southern印记杂交。第二代方法包括专注于发现正常组织和癌组织中不同的甲基化区域或分析肿瘤抑制基因甲基化特征的方法。这些技术大致可分为：1)CpG位点检测方法，包括MSP，qMSP和巢式MSP；2)详细分析特定CpG位点甲基化模式的方法，例如亚硫酸盐测序；3)基因组范围使用基于阵列检测的方法，如Illumina。

上述方法大多包括DNA提取及重亚硫酸盐转化步骤。DNA提取通常涉及样本裂解、有机溶剂提取、乙醇沉淀、DNA结合和洗脱等步骤。提取的DNA进行重亚硫酸盐转化，需要经过DNA变性、非甲基化胞嘧啶脱氨基及去磺化等步骤。考虑到这些步骤，传统方法存在步骤多、过程繁琐、DNA损耗大、时间长、无法自动化等缺点。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用，其目的在于减少游离DNA提取转化过程中的损失，使操作更加简便、高效、降低成本并利于自动化操作。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，包括以下步骤：

1)裂解：向血浆中加入蛋白酶K和裂解缓冲液进行裂解，所述裂解缓冲液为SDS、EDTA和Tris-HCl的混合液；

2)转化：向步骤1)产物加入转化混合液，进行转化，所述转化混合液为氢氧化钠、对苯二酚和亚硫酸氢钠的混合液；

3)结合：向步骤2)混合液加入结合液及磁珠，室温静置后进行磁分离，所述结合液为盐酸胍、柠檬酸及异丙醇混合液；

4)漂洗：将得到的磁珠用漂洗液进行漂洗；

5)漂洗后的磁珠经干燥后加入洗脱液，室温静置后进行磁分离，洗脱后的上清液为提取转化后的游离DNA。

优选地，步骤1)所述血浆与所述裂解缓冲液的体积比为1:(0.1-0.4)，优选为1:0.3；所述SDS在裂解缓冲液中的质量百分比浓度为1-5％，优选为2％；所述EDTA在裂解缓冲液中的摩尔浓度为10-100mM，优选为50mM；所述Tris-HCl在裂解缓冲液中的摩尔浓度为50-150mM，优选为100mM。

优选地，步骤1)所述血浆与蛋白酶K的体积比为(5-15):1，优选为10:1；所述蛋白酶K的浓度5-20mg/ml，优选为10mg/ml。