[发明专利]一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗原包被的酶标板、定标品、样本稀释液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液，所述酶标板为两个，其中一个包被S蛋白的RBD抗原；另一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别用封闭液进行封闭；所述封闭液为含牛血清白蛋白的PBS溶液；所述样本稀释液为含牛血清白蛋白的PBST溶液；所述酶标二抗为HRP标记的鼠抗人IgG抗体；所述显色液为TMB底物液，所述终止液为硫酸溶液；

样本稀释液的配方为：含0.1％-0.5％BSA的PBST溶液，Tween-20含量为0.05％-1％Tween-20；

洗涤液的配方为：10mmol/L-50mmol/L Tris-HCl，0.05％-1％Tween-20；

定标品配制：用样品稀释液分别将RBD中和抗体稀释至0、1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和NTD中和抗体稀释至覆盖线性范围的6个定标品0、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；

所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH为8.5-9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD至3μg/mL，分别包被至两个酶标板中；每孔加入80μL，分别贴好盖板膜，分别在4℃贴包被16h后甩干，分别用洗涤液洗涤5次；每孔均加入封闭液280μL，36-38℃封闭2h后甩干，分别用洗涤液洗涤3次，贴好盖板膜，即得所述抗原包被的酶标板；

所述酶标二抗的制备方法，包括以下步骤：

A:将1mL的13mg/mL NaIO₄水溶液与1mL的5mg/mL HRP水溶液于4℃混合反应50min，制成活化的HRP溶液；然后，向所述活化的HRP溶液中加入0.5mL的90％乙二醇水溶液室温避光反应50min，得到HRP混合溶液；

B:将经过0.5moL/L pH为9.0碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的鼠抗人IgG抗体与步骤A得到的HRP混合溶液按质量比1:1进行混合，于4℃透析过夜，得到透析好的抗体；

C.向步骤B得到的所述透析好的抗体中加入6mg/mL的NaBH₄溶液100μL，4℃反应3h，然后装入透析袋中，于20mM，pH为7.4PBS溶液中4℃透析过夜；

D.在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置4℃反应1.5h；于5000rpm转速离心25min弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次；然后将沉淀物溶于20mM的PBS溶液；将上述溶液于20mM的PBS溶液中透析后，10000rpm离心30min，去除沉淀，取上清液即为酶标二抗。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于：封闭液中，PBS溶液中牛血清白蛋白的浓度为1-5wt％。

3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清；所述阳性对照血清包括新型冠状病毒RBD疫苗免疫人获得的高免血清和NTD疫苗免疫兔获得的高免血清。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照血清为未感染新型冠状病毒且未经免疫的人的血清。

5.根据权利要求1所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于：所述RBD中和抗体或NTD中和抗体的浓度均为200-5000ng/mL。

6.根据权利要求1所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的浓度为1:2000-1:10000。

7.根据权利要求1所述的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述硫酸溶液的浓度为1.5mol/L-2mol/L。