[发明专利]一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法

说明书

本发明公开了一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，步骤包括：1)分别提取中华刺鳅和大刺鳅基因组DNA；2)PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，得到目的片段的PCR产物；3)扩增产物纯化后，直接测序，中华刺鳅和大刺鳅扩增产物序列比对，序列的第108、110和111位点碱基为C、C和T的是中华刺鳅，序列的第108、110和111位点碱基为T、T和C的则是大刺鳅。采用本发明能够经济、快速、简便的进行中华刺鳅和大刺鳅的鉴定，结果稳定性好，重复率高，这种鉴定方法将在资源调查中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于分子鉴别形似近缘物种技术领域，具体涉及一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法。

背景技术

中华刺鳅(Sinobdella sinensis)和大刺鳅(Mastacembelus armatus)隶属于合鳃目刺鳅科，是生活于浅水区的中小型鱼类。中华刺鳅主要分布于我国辽河、黄河、长江、钱塘江、珠江等各大水系，而大刺鳅我国长江以南的各大水系。中华刺鳅和大刺鳅的实用价值较低，但是目前已作为观赏鱼类开发。近20年来，由于自然水体的污染，中华刺鳅和大刺鳅在野外水体的数量已经明显下降，相关资源调查的研究和保护工作亟待开展。

中华刺鳅和大刺鳅外部形态相似、鉴别特征不显著、容易混淆，形态分类学上大刺鳅臀鳍刺少，吻突尖长，口裂较短，斑条不明显，个体也较大。中华刺鳅之前被纳入刺鳅属，通过骨骼比对分析后，又被单独为中华刺鳅属。长江以南水系，中华刺鳅和大刺鳅存在混栖，大刺鳅幼体与中华刺鳅个体形态相似，在鱼类调查中难以区分鉴别，不利于资源的保护和管理。因此，需要一种快捷方便、准确可靠的鉴别中华刺鳅和大刺鳅的方法。

发明内容

针对中华刺鳅和大刺鳅形态区分的困难，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，通过设计引物对实现对上述物种的高效鉴别。

因此，作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，其包含以下步骤，(1)分别提取待鉴定的中华刺鳅和大刺鳅因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，得到目的片段的PCR产物；(3)扩增产物纯化后，直接测序，进行中华刺鳅和大刺鳅扩增产物序列比对，序列的第108、110和111位点碱基为C、C和T的是中华刺鳅，序列的第108、110和111位点碱基为T、T和C的则是大刺鳅。优选的，所述的PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，其使用的上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，下游引物如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。

优选的，所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。

作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅分子鉴别的引物对，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物如序列如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。

作为本发明的一个方面，本发明提供一种上述引物对在制备中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别试剂中的应用。

作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别试剂，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物如序列如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。