[发明专利]一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法及指纹图谱有效
申请号: | 202010953789.8 | 申请日: | 2020-09-11 |
公开(公告)号: | CN112268976B | 公开(公告)日: | 2022-05-20 |
发明(设计)人: | 潘巧贝;郑数数 | 申请(专利权)人: | 浙江磐康药业有限公司 |
主分类号: | G01N30/88 | 分类号: | G01N30/88 |
代理公司: | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人: | 王丰毅 |
地址: | 322300 浙江省*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 区分 覆盆子 甜叶悬 钩子 hplc 指纹 图谱 建立 方法 | ||
1.一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,采收掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子;
步骤二,预处理:分别称取掌叶覆盆子果实和甜叶悬钩子果实各100 g,进行烘干10h处理,使其完全干燥,将烘干后的果实进行粉碎,并全部过四号筛,即得均一的两种样品粉末;
步骤三,有效成分的提取:
鞣化酸对照品溶液的配制:取鞣花酸对照品适量,精密称定,加70%甲醇制成每1ml含5μg鞣花酸的溶液,即得;
分别准确称取两种果实粉末各2.0-4.0g置于两个三角烧瓶中,按料液比1:35加入70-80%甲醇,称定重量,超声处理20-40min,80-95℃回流1.5h,冷却至室温10-30℃,用70-80%甲醇补重后,过滤,精密量取10mL液体至蒸发皿中,蒸干后,用甲醇转移至5mL容量瓶中;
步骤四,HPLC指纹图谱的确定:
将步骤三获得的两种果实的提取物,分别用0.45μm微孔滤膜过滤后,制得待测溶液,得到两种果实的HPLC指纹图谱;
步骤五,图谱的处理:
用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理所得图谱;
所述步骤五,用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理所得图谱时,HPLC的色谱条件为:仪器:Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪;色谱柱:inertsil ODS-3 5μm,4.6×250mm;检测器:Agilent G7115A DAD检测器;流动相:0.4%甲酸:乙腈;柱温:25-35℃;流速:1.0mL/min;进样体积:10-20μL;
所述甜叶悬钩子流动相比例为:
指纹图谱运行0-25分钟,0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到75.2%,同时乙腈的比例从5%升高到24.8%;
指纹图谱运行25-40分钟,0.4%的甲酸水溶液从75.2%的比例下降到70.9%,同时乙腈的比例从24.8%升高到29.1%;
指纹图谱运行40-57分钟,0.4%的甲酸水溶液从70.9%的比例下降到63.4%,同时乙腈的比例从29.1%升高到36.6%;
指纹图谱运行57-77分钟,0.4%的甲酸水溶液从63.4%的比例下降到53%,同时乙腈的比例从36.6%升高到47%;
指纹图谱运行77-90分钟,0.4%的甲酸水溶液从53%的比例下降到43.7%,同时乙腈的比例从47%升高到56.3%;
指纹图谱运行90-120分钟,0.4%的甲酸水溶液从43.7%的比例下降到36.6%,同时乙腈的比例从56.3%升高到63.4%;
指纹图谱运行120-150分钟,0.4%的甲酸水溶液从36.6%的比例下降到0%,同时乙腈的比例从63.4%升高到100%;
所述掌叶覆盆子流动相比例为:
指纹图谱运行0-8分钟,0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到90.6%,同时乙腈的比例从5%升高到9.4%;
指纹图谱运行8-27分钟,0.4%的甲酸水溶液从90.6%的比例下降到83%,同时乙腈的比例从9.4%升高到17%;
指纹图谱运行27-55分钟,0.4%的甲酸水溶液从83%的比例下降到78.9%,同时乙腈的比例从17%升高到21.1%;
指纹图谱运行55-79分钟,0.4%的甲酸水溶液从78.9%的比例下降到53.3%,同时乙腈的比例从21.1%升高到46.7%;
指纹图谱运行79-86分钟,0.4%的甲酸水溶液从53.3%的比例下降到32.6%,同时乙腈的比例从46.7%升高到67.4%;
指纹图谱运行86-90分钟,0.4%的甲酸水溶液从32.6%的比例下降到0%,同时乙腈的比例从67.4%升高到100%;
所述区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的流动相比例为:
指纹图谱运行0-10分钟,0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到89.5%,同时乙腈的比例从5%升高到10.5%;
指纹图谱运行10-25分钟,0.4%的甲酸水溶液从89.5%的比例下降到84.5%,同时乙腈的比例从10.5%升高到15.5%;
指纹图谱运行25-47分钟,0.4%的甲酸水溶液从84.5%的比例下降到76.3%,同时乙腈的比例从15.5%升高到23.7%;
指纹图谱运行47-60分钟,0.4%的甲酸水溶液从76.3%的比例下降到35%,同时乙腈的比例从23.7%升高到65%;
指纹图谱运行60-75分钟,0.4%的甲酸水溶液从35%的比例下降到15.8%,同时乙腈的比例从65%升高到84.2%。
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