[发明专利]一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法有效
| 申请号： | 202010956243.8 | 申请日： | 2020-09-11 |
| 公开（公告）号： | CN112126643B | 公开（公告）日： | 2022-04-15 |
| 发明（设计）人： | 臧远胜;马跃;张亚楠 | 申请（专利权）人： | 上海长征医院;上海思路迪生物医学科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京市兰台律师事务所 11354 | 代理人： | 于越;张峰 |
| 地址： | 200003 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 分离 外泌体中 ecdna 方法 | ||
1.一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，其特征在于，包括：
使用碱性洗涤磁珠法处理外泌体产物获得ecDNA产物；
所述碱性洗涤磁珠法包括使用磁珠悬液II对外泌体裂解后的产物进行核酸吸附操作，所述外泌体裂解包括使用裂解液对外泌体产物进行裂解操作，所述裂解液包括蛋白酶抑制剂；使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作；使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；使用洗脱液对经过洗涤液III洗涤操作的磁珠进行洗脱操作，使磁珠上吸附的ecDNA被洗脱；
所述裂解液包括终浓度为3至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.15至3mmol/L的NaCl、1至15mmol/L的PMSF和体积比为1至10％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25至50％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为20至100mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10至12；
所述洗涤液III包括浓度为10至20mmol/L的Tris、终浓度为0.5至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75至80％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为10至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸吸附操作包括加入磁珠悬液II震荡混匀，室温孵育3分钟，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗涤操作包括加入洗涤液震荡混匀，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗脱操作包括加入洗脱液震荡混匀，50℃孵育10分钟，瞬时离心5秒，吸磁后收集上清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解操作包括加入裂解液震荡混匀，室温孵育5分钟。
4.一种用于分离外泌体中ecDNA的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括裂解液、磁珠悬液II、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液；
所述裂解液包括终浓度为3至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.15至3mmol/L的NaCl、1至15mmol/L的PMSF和体积比为1至10％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25至50％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为20至100mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10至12；
所述洗涤液III包括浓度为10至20mmol/L的Tris、终浓度为0.5至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75至80％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为10至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
5.如权利要求4所述的试剂组合，其特征在于，
所述裂解液包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为1mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10；
所述洗涤液III包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为10mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
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