[发明专利]一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法

说明书

本发明涉及一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，通过磁珠法高选择性的分离外泌体中ecDNA，无需使用超速离心等复杂操作，也避免使用氯化铯等有毒试剂，能够适应自动化操作分离得到较高纯度ecDNA产物，极大地提高了实验效率，有效节省人力、时间成本。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法。

背景技术

外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。

几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。

ecDNA是近期肿瘤学领域的研究热点，国内外的相关研究还处于起步阶段。ecDNA指的是从染色体上脱落，脱离染色体以环状结构存在的DNA。研究表明ecDNA普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并可能与肿瘤的耐药相关。

目前，可查询的文献报道目前关于ecDNA提取的方法主要是采用氯化铯梯度离心法进行提取，氯化铯梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法，用超速离心机对小分子物质溶液长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。经过高速离心后DNA、RNA等物质会形成一个连续的浓度梯度，ecDNA会悬浮于某一层，进而可以收集纯化获得较高纯度的ecDNA。

但是使用氯化铯梯度离心法提取ecDNA存在诸多缺点，例如：提取实验过程中使用氯化铯以及溴化乙锭均为有毒试剂，对操作人员身体和环境可能造成危害；操作过程中离心次数较多，还需要使用超速离心机，且ecDNA分层吸取技术较难，实验整体复杂，必须由经过培训的专业人士进行操作；实验耗时久、成本高，无法进行自动化操作。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，通过磁珠法高选择性的分离外泌体中ecDNA，无需使用超速离心等复杂操作，也避免使用氯化铯等有毒试剂，能够适应自动化操作分离得到较高纯度ecDNA产物，极大地提高了实验效率，有效节省人力、时间成本。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，包括：

使用碱性洗涤磁珠法处理外泌体产物获得ecDNA产物；

所述碱性洗涤磁珠法包括使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作，和，使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；

所述洗涤液II的pH为7至12；

所述洗涤液III包含有蛋白酶。

进一步地，所述碱性洗涤磁珠法包括：

使用磁珠悬液II对外泌体裂解后的产物进行核酸吸附操作；

使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作；

使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；

使用洗脱液对经过洗涤液III洗涤操作的磁珠进行洗脱操作，使磁珠上吸附的ecDNA被洗脱。

进一步地，所述外泌体裂解包括使用裂解液对外泌体产物进行裂解操作；所述裂解液包括蛋白酶抑制剂。