[发明专利]制备气道细胞的组合物和方法

说明书

本发明提供了制备气道细胞的组合物和方法。在一个方面，描述了源自诱导多能干(iPS)细胞的上皮气道细胞，其特征在于表达气道细胞表面标记和增殖的能力。在另一个方面，提供了将iPS分化为上皮气道细胞的方法。还公开了工程化肺、制造包括上皮气道细胞的这样的工程化肺和治疗呼吸障碍的方法。

本申请是分案申请，原申请的申请日为2015年1月14日、申请号为2015800045414、发明名称为“制备气道细胞的组合物和方法”。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年1月14日提交的美国临时专利申请号61/927,097的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文，如同以其全部在本文陈述一样。

发明背景

在美国，有大约30,000人患有囊性纤维化(CF)，并且每年诊断出大约1,000例新的CF。CF是最严重地影响肺以及胰腺、肝和肠的常染色体隐性遗传病。其特征在于异常地输送氯化物和钠穿过上皮，导致稠密的、粘性的分泌物。患有CF的人中最常见的死亡原因是呼吸衰竭。多个研究已经显示囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因的突变可以损害折叠、分泌、细胞表面稳定性、和/或穿过上皮的CFTR氯离子通道的功能。虽然在进行巨大的努力以鉴定靶向CFTR结构缺陷的化合物，但是到目前为止它们的临床疗效被证明很差，这凸显出更好地理解CFTR调节的分子机制的必要性，其是用于研发更有效的疗法的先决条件。

在气道中，CFTR突变对近端气道上皮细胞具有很大影响。CF研究中的主要困难之一是缺少供机制研究和药物研发使用的活的人近端气道上皮细胞——细胞类型受CFTR突变选择性地影响。CF的动物模型通常不非常好地重演人的状况。

已经显示诱导多能干(iPS)细胞展示了发育为肺泡上皮细胞的潜能。多个研究组已经报道，使用多种方案朝向肺泡II型细胞分化ESC和iPS细胞。然而，仍然很差地理解这些极度重要的气道疾病的许多方面。

因此，本领域中存在用于鉴定将要在肺相关疗法中使用的功能性气道上皮细胞的可靠来源的需求。

发明内容

本发明包括制备气道上皮细胞的组合物和方法，该气道上皮细胞可以在组织工程中使用并且可以用于治疗呼吸障碍。

在一个方面，本发明包括源自诱导多能干(iPS)细胞的气道上皮细胞，其特征在于气道细胞表面标记的表达——其中气道细胞表面标记包括克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和FOXJ1——和在培养中增殖而不丧失气道细胞表面标记的能力。在一个方面，本发明包括将诱导多能干(iPS)细胞分化为气道上皮细胞的方法，其包括在缺乏血清的情况下培养iPS细胞以诱导分化为定形内胚层(DE)细胞，在存在血清的情况下培养DE细胞以诱导分化为前前肠内胚层(anterior foregut endoderm)(AFE)细胞，并且在存在血清、细胞因子混合物(cocktail)和高浓度的视黄酸的情况下培养AFE细胞以诱导AFE细胞分化为气道上皮细胞。在另一个方面，本发明包括工程化三维肺组织的方法，其包括将诱导多能干(iPS)细胞群分化为气道上皮细胞——其中气道上皮细胞表达包括克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和FOXJ1的气道细胞表面标记；并且能够在培养中增殖而不丧失气道细胞标记——和将气道上皮细胞接种在三维支架上。在又另一个方面，本发明包括包含本文所述的气道上皮细胞的工程化三维肺组织。

在本文描绘的本发明的以上方面或任何其它方面的多种实施方式中，本发明包括有纤毛的气道上皮细胞。在另一个实施方式中，气道上皮细胞源自囊性纤维化人iPS细胞。在又另一个实施方式中，气道上皮细胞能够在培养中增殖至少大约30天，比如大于大约30天。

在另一个实施方式中，气道细胞表面标记的表达进一步包括囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，和/或β-微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63中的至少一种。在又另一个实施方式中，气道细胞表面标记以比得上在新鲜分离的人气道细胞上表达的水平表达。