[发明专利]一种小胶质细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种小胶质细胞的培养方法，包括将组织移入装有预冷HBSS的离心管中处理；弃去上层清液，加入预热的含白血病抑制因子（LIF）的胰酶，轻微摇晃使组织与消化液充分接触，得到组织溶液；在胎牛血清的培养基中添加LIF；在组织溶液中加入等体积的上述培养基终止消化；加入含LIF的培养基，用枪尖反复吹打使细胞分散过滤，得到单细胞悬液；将单细胞悬液接种于若干个细胞培养瓶中进行培养。实现在传统混合胶质细胞培养方法的基础上，在胰酶与培养基中加入LIF，并采用摇床震荡法分离小胶质细胞，可获得不易激活的小胶质细胞，对获得处于静息状态的神经胶质细胞用于药物评价实验有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小胶质细胞的培养方法。

背景技术

在神经系统疾病（如脑老化及阿尔茨海默病、帕金森氏病）的药物开发过程中，原代神经细胞的培养是一个非常重要的环节，这对体外评估药物的疗效和毒性起着至关重要的作用。随着人年龄的增加，神经退行性疾病的患病风险也随之大大增加。几乎所有的神经退行性疾病都伴随着不同程度的炎症反应，表现为神经胶质细胞的激活尤其是小胶质细胞的激活。而不同类型小胶质细胞的激活往往对应着不同的病理反应，如M2型小胶质细胞的激活是细胞保护性的，而M1型小胶质细胞的激活却是毒促反应性的。为了弄清楚各种疾病和这些炎症反应之间的关系，在科研实验中，经常需要培养原代胶质细胞。原代神经胶质细胞的培养通常包括以下步骤：取脑-分离脑膜取皮层-胰酶消化，离心-沉淀溶解，过滤-培养至融合-差速离心分离。该过程使用含有10%-20%胎牛血清的DMEM培养基。在经历以上过程获得的分离出来的小胶质细胞无法增殖，容易激活，十分娇贵，稍有不慎就会导致后续实验难以开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小胶质细胞的培养方法，旨在解决传统的小胶质细胞的培养方法小胶质易激活，会导致后续药物评价实验难以开展的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种小胶质细胞的培养方法，包括：

将组织移入装有预冷HBSS的15ml的离心管中，1000rpm离心3min；

弃去上层清液，加入预热的含白血病抑制因子的0.25％胰酶，轻微摇晃使组织与消化液充分接触，得到组织溶液；

在含10％胎牛血清的DMEM培养基中添加终浓度为10μg/L的白血病抑制因子；

在组织溶液中加入等体积的已加入白血病抑制因子的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心3min；

加入10ml已加入白血病抑制因子的DMEM培养基，用枪尖反复吹打使细胞分散，75μm滤网过滤，得到单细胞悬液；

将单细胞悬液接种于若干个25cm²细胞培养瓶中进行培养。

在一实施方式中，轻微摇晃使组织与消化液充分接触，具体包括：

37℃消化20-30min，15min摇晃一次。

在一实施方式中，在组织溶液中加入等体积的已加入白血病抑制因子的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心3min之后，所述方法还包括：

用1ml移液枪吸去上层清液及絮状物。

在一实施方式中，75μm滤网过滤之前，所述方法还包括：

将滤网用10ml已加入白血病抑制因子的DMEM培养基清洗一次。

在一实施方式中，将单细胞悬液接种于若干个25cm²细胞培养瓶中进行培养，包括：

将培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。