[发明专利]一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法

说明书

本发明属于分离培养原代干细胞技术领域，公开了一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置；采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO₂饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞48h～96h；细胞克隆出现后用D‑PBS洗3遍，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养至3～4代冻存备用。本发明所配置的培养液能100％确保在96h内分离培养动物原代干细胞时无细菌性污染发生。同时本发明所采用的培养液能够保证分离的动物原代细胞保持干细胞特性。本发明能够确保在从动物组织中分离培养原代的干细胞的过程不发生细菌或真菌性污染。

技术领域

本发明属于分离培养原代干细胞技术领域，尤其涉及一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法。

背景技术

目前，动物是干细胞的重要来源和研究素材。从动物机体组织中分离培养原代干细胞首先面临的就是来自于组织和操作过程中所带来的细菌或真菌污染常常导致原代干细胞分离培养失败，带来的损失有时无法估量，尤其是珍稀野生动物或高价值动物原代干细胞，损失更大。通常，大家在初次从组织中分离原代干细胞时在PBS和培养基中加入1％的双抗来达到除菌的目的。但在实际中，这样做远远不够，经常导致培养的干细胞发生污染而导致原代干细胞分离培养失败。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中从动物机体组织中分离培养原代干细胞，经常导致培养的干细胞发生污染而导致原代干细胞分离培养失败。

解决以上问题及缺陷的难度为：在保证所分离培养的动物干细胞不发生分化的前提下不发生污染。

解决以上问题及缺陷的意义为：能够确保所分离培养的干细胞不发生分化情况下并确保不发生细菌性污染。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法。

本发明是这样实现的，一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，所述动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，包括：

步骤一，无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min；

步骤二，采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO₂饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞48h～96h；

步骤三，细胞克隆出现后用D-PBS洗3遍，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养至3～4代冻存备用。

进一步，所述培养基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mL LIF、5ng/mL bFGF、15％FBS、青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、两性霉素B5μg，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。

进一步，所述培养液II：青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素、15μg两性霉素B5μg，D-PBS定容至100mL，4℃保存。

进一步，所述培养液III：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mL LIF、5ng/mL bFGF+15％FBS，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。

本发明满足动物干细胞的生长营养需求，保证动物干细胞培养过程中不发生细菌性污染。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明所配置的培养液能100％确保在96h内分离培养动物原代干细胞时无细菌性污染发生。同时本发明所采用的培养液能够保证分离的动物原代细胞保持干细胞特性。

附图说明