[发明专利]一种分离制备飞燕草素-3-O-(6-O-对香豆酰)葡萄糖苷的方法

权利要求书

1.一种分离制备飞燕草素-3-O-(6-O-对香豆酰)葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)醇提浓缩：以葡萄为原料，经酸性乙醇溶液醇提浓缩得到葡萄皮花色苷粗提液；

步骤(1)的酸性乙醇溶液中，乙醇体积浓度为50％-80％，酸体积浓度为0.1％-1％；

(2)大孔树脂纯化：将所述葡萄皮花色苷粗提液注入大孔树脂，经洗脱，浓缩得到花色苷洗脱液；所述大孔树脂选自AB-8，D101，XAD-7，HPD-100或DM-130，其比表面积为450-550m²/g，平均孔径为10-50nm，粒径范围在0.3-1.25mm；

(3)萃取：先使用有机溶剂萃取所述花色苷洗脱液，再经减压浓缩，冻干后得到花色苷冻干粉；

(4)制备液相色谱纯化：将花色苷冻干粉溶解，注入液相色谱柱为C18柱的制备型液相色谱系统中进行纯化，并用紫外检测器下检测，具体参数条件如下：

流动相：A相为纯乙腈，B相为甲酸体积百分浓度为1％～2％的甲酸水溶液；

梯度洗脱程序为：0-4min，5％-20％A相；4-18min，20％-25％A相；18-21min，25％-35％A相；21-24min，35％-60％A相；24-27min，60％-5％A相；27-30min，5％A相；

流速为8-10mL/min，柱温为30℃，检测波长为520nm；

根据液相色谱图收集保留时间为16.5-18.0min的组分，之后减压浓缩，冻干，得到花色苷单体粗品；

(5)高速逆流色谱分离：将体积比为2:2:3:0.001的甲基叔丁基醚、甲醇、水和三氟乙酸混合作为两相溶剂体系，且以上相为固定相，下相为流动相，依次将固定相和流动相泵入高速逆流色谱仪器中，流动相流速2mL/min，两相在管路中达到平衡后，将花色苷单体粗品用流动相溶解，进样并在紫外检测器下检测，检测波长为280nm，收集保留时间为105-115min的组分并减压浓缩、冻干，得到目标化合物飞燕草素-3-O-(6-O-对香豆酰)葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇提浓缩，具体为：将葡萄洗净取皮，与酸性乙醇溶液混合，混匀后打浆，50℃以下超声提取，过滤，滤液在40-50℃减压浓缩除去乙醇，得到葡萄皮花色苷粗提液；

葡萄皮与酸性乙醇溶液的料液比为1g:4-8mL；

所述超声提取时间为40-120min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸性乙醇溶液中，酸选自盐酸、甲酸、乙酸中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述大孔树脂纯化方法具体为：

将葡萄皮花色苷粗提液注入大孔树脂中，之后依次用乙醇体积浓度为0，5％，20％，40％的酸性乙醇溶液各4倍柱体积洗脱，收集乙醇体积浓度为40％的酸性乙醇洗脱液，40-50℃减压蒸发除去乙醇，得到花色苷洗脱液；

步骤(2)的酸性乙醇溶液选自酸的体积百分浓度为0.1％～1.5％的乙醇溶液，其中酸选自盐酸、甲酸、乙酸中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，制备型液相色谱系统单次进样量以花色苷冻干粉计为10-40mg，所述减压浓缩后的体积为浓缩前体积的40％-70％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，高速逆流色谱仪器温度稳定在20-30℃，正接正转，泵入固定相，之后调节转速至800-950r/min，以2mL/min的流速通入流动相并使之平衡，每次进样量以花色苷单体粗品计为30-200mg。