[发明专利]一种分离制备飞燕草素-3-O-(6-O-对香豆酰)葡萄糖苷的方法

说明书

本发明公开了一种分离制备飞燕草素‑3‑O‑(6‑O‑对香豆酰)葡萄糖苷的方法，通过提取，大孔树脂纯化，萃取，制备液相色谱和高速逆流色谱等步骤，从葡萄中分离纯化得到高纯度的飞燕草素‑3‑O‑(6‑O‑对香豆酰)葡萄糖苷单体。通过该方法可以从10kg的葡萄皮中获得至少80mg的飞燕草素‑3‑O‑(6‑O‑对香豆酰)葡萄糖苷，纯度可达到不低于98％。本方法具有操作简单，处理量大，重复性好等优点，为我国葡萄资源的开发利用提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及天然产物的分离纯化技术领域，具体涉及一种分离制备飞燕草素-3-O-(6-O-对香豆酰)葡萄糖苷的方法。

背景技术

葡萄是葡萄科葡萄属植物的果实，在世界各地均有栽培。葡萄具有很高的营养价值。中医认为葡萄性平、味甘，能补气血，强心利尿。现代研究表明，葡萄中不仅有维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E等维生素，还含有白藜芦醇，原花青素，花色苷等丰富的多酚类化合物，具有抗氧化，保护心血管，抗肿瘤，抗菌等生物活性。

花色苷是葡萄中重要的多酚类物质之一，研究表明，葡萄中含有飞燕草素、锦葵素、芍药素和矮牵牛素等花青素苷元与葡萄糖结合形成的花色苷。近年来的研究证实了天然果蔬来源的花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、控制肥胖和预防心血管疾病等生物活性。但由于花色苷对光、温度和pH敏感，导致其化学性质相对不稳定，而且生物利用度较低，这些性质极大地限制了花色苷的实际应用。已有研究表明，相对于非酰化花色苷，酰化花色苷同样具有生物活性，并且有更稳定的化学性质以及更高的生物利用度。而葡萄中含有大量对香豆酰化的花色苷，这说明葡萄花色苷具有更好的市场前景。

近年来，固相萃取技术(SPE)、制备型高效液相色谱技术(preparative-HPLC)和高速逆流色谱技术(HSCCC)等新型纯化技术开始得到发展和应用。高效液相色谱是基于固液吸附原理的色谱技术，通过使用硅胶等吸附剂作为固定相，根据不同化合物分子与固定相的结合能力的差异性而分离，分离效果主要取决于固定相填料的性质(如组成，粒径大小)，以及液相色谱方法是否良好。高效液相色谱技术具有稳定、可靠、重复性好等优点。逆流色谱是一种液液色谱技术，其固定相和流动相都是液态的，原理是根据不同化合物分子在固定相和流动相的分配系数的差异而分离。逆流色谱法的分离效果，主要取决于使用的两相溶剂体系是否合适。逆流色谱技术具有样品前处理简单、适用范围广、样品损失少、处理量大等优点。目前在葡萄花色苷的制备中，主要采用萃取、大孔树脂和单一的柱层析或色谱技术进行分离纯化。

如公开号CN104177460A的中国专利文献中公开了一种3,5-二糖类花色苷的制备方法，该方法使用超声辅助提取、萃取、纯化等步骤，其中使用了优化的超声辅助提取方法减少了提取剂的使用，采用凝胶柱和大孔树脂结合的方法，简化了操作。但获得的产物为花色苷混合物，含有三种不同的二糖类花色苷，并且产物不涉及酰化花色苷。

又如公开号CN102229633A的中国专利文献中公开了一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法。该方法使用浸提，大孔树脂纯化，制备液相的方法纯化得到了五种花色苷，然而由于使用了两步制备液相纯化，导致样品损耗，降低了纯化得率，且其中两种酰化花色苷(锦葵素乙酰葡萄糖苷，锦葵素反式香豆酰葡萄糖苷)的纯度相对较低，分别仅为91.7％和95.5％。

公开号CN108976268A的中国专利文献中公开了一种制备刺葡萄两个主要花色苷标准品的方法，该方法采用大孔树脂对刺葡萄浊汁进行吸附富集，随后经过洗脱，冷冻干燥得到花色苷粗品，再使用高速逆流色谱，以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(体积比5：4：1：2：0.001或5：3：1：1：0.001)为两相溶剂体系分离，得到两种花色苷，纯度分别为95.8％和92.2％。该技术方案虽然公开其分离得到两种花色苷，但是从图1的刺葡萄浊汁HPLC图中，可以看到其花色苷组成简单，由高速逆流色谱的局限性可推测出，当分离的样品花色苷组分复杂时，使用该方法可能难以得到目标花色苷。