[发明专利]一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法

权利要求书

1.一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：

S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N-二甲基甲酰胺、1-乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；

S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9-3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8-1.2g，在95-100℃的油浴的条件下搅拌1.5-2.5h，加入氯乙酸1.7-2.2mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40-50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8-2mol/L的HCl调pH＝1.8-2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；

S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09-0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；

S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23-85mg，分别加入2-6mLDMF、120-160mgEDC充分溶解，活化5-7h，将40-60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420-440μL活化液，2-6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13-17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白，用作包被原；

S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；

S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。

2.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2中的蒸馏水通过Milli-Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli-Q型超纯水仪的参数是流量：0.8-1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。

3.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2的搅拌过程采用的是90-2型恒温磁力搅拌器，所述90-2型恒温磁力搅拌器的参数是工作电压：AC220V±10％；50HZ，搅拌容量：20-3000ml，搅拌速度：0-1250转/分，定时时间：0-120分。

4.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2中的PH检测采用的是BPP-7800型精密PH计，所述BPP-7800型精密PH计的测量范围是-2.000-20.000pH之间，且精度是±0.002pH。

5.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S4中的洛克沙胂-牛血清白蛋白在纯化后冻存保存在-20℃的DRH-A100型电热恒温培养箱中。

6.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S3中的薄层色谱法采用的是MultiskanFC型全自动酶标仪，所述MultiskanFC型全自动酶标仪的参数为检测波长范围从340到850nm，并且采用所述96孔可拆酶标板。