[发明专利]一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法

说明书

本发明公开了一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法；S1、选取实验耗材；S2、半抗原的改造，制备化合物A；S3、制备化合物B；S4、洛克沙胂人工抗原的合成；S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备；S6、间接ELISA方法的建立；本发明以4‑羟基苯胂酸作为半抗原修饰物，在第3位和第4位上分别引入硝基和羧基，合成了与ROX结构相似的衍生物，并采用碳二亚胺法将ROX衍生物与BSA、OA偶联，成功制备了ROX的人工抗原，经生物质谱鉴定，ROX‑BSA、ROX‑OA的偶联比分别为4.2:1、12.6:1，免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体最大效价可达1.28×105，对ROX的IC50为41.08ng/mL，该抗体特异性较强。

技术领域

本发明属于人工抗原制备技术领域，具体涉及一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。

背景技术

合成抗原将氨基酸按一定顺序聚合成大分子多肽，使其具有抗原的性质，亦称合成多肽抗原。因其结构是已知的，故多用于蛋白质构型与抗原特性的关系和抗原抗体反应机理的研究，也可用以制备合成肽疫苗，洛克沙胂是用于畜禽促生长的一种最经济的多功能有机砷饲料添加剂，具有抗球虫、治痢疾、沉积色素、改善毛色、提高产蛋率、降低料肉比等功效，可与多种抗生素、促生长剂配合使用,洛克沙胂价格低廉，已广泛的应用在规模化的养鸡场中。洛克沙胂等砷类化合物具有一定毒性，可影响机体酶的活性，导致细胞代谢紊乱，进而容易造成中枢神经失调，亦可引起细胞DNA损伤。如果在饲养过程中洛克沙胂使用过量，必定会造成其在畜禽体内残留，严重威胁人类的健康，国内外文献中所报道的洛克沙胂残留检测方法多为高效液相色谱法、固相萃取-高效液相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体-串联质谱法、液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用法等仪器方法，由于这些方法所需设备昂贵、操作复杂、耗费时间长，因此只适于实验室研究，不易推广。目前，关于洛克沙胂免疫学检测的文献报道较少，2011年，SHELVER以3-氨基-4-羟基苯胂酸(AHPA)为半抗原修饰物，将AHPA与钥孔血蓝蛋白偶联，合成了洛克沙胂的人工抗原，建立了一种鸡肉中洛克沙胂的间接ELISA检测方法，该方法的IC50为12.0±2.45ng/mL。2019年，刘红亮等采用碳二亚胺法将AHPA与BSA偶联，该抗体对洛克沙胂的IC50为3.147ng/μL，但未对实际样品进行检测。为了探索最适的免疫学检测方法，有必要通过多种方法合成洛克沙胂的多种人工抗原，筛选出一种具有高活性的人工抗原，更大程度的提高ELISA检测的特异性和灵敏度，以便于进一步应用和推广，然而市面上各种的洛克沙胂的多种人工抗原仍存在各种各样的问题。

如授权公告号为CN103232572B所公开的用于检测洛克沙胂的分子印迹聚合物及其制备方法，其虽然实现了分子印迹聚合物对洛克沙胂回收率为90％以上，对洛克沙胂显示高的交叉反应，具有高的选择性和特异性，作为分析饲料、动物组织及环境水等基质中洛克沙胂的样品净化前处理材料有着广泛的应用前景，但是并未解决现有洛克沙胂半抗原在制备生产的时候不能够快速的进行洛克沙胂半抗原的生成，使得抗体特异性较强，并且不能够实现对洛克沙胂半抗原的精准检测的问题，为此我们提出一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，以达到实现人工抗原制造、修饰改造的目的。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：

S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N-二甲基甲酰胺、1-乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；