[发明专利]IL-6R抑制剂及IL-4R抑制剂联合用药在乳腺癌化疗药物的中的应用

权利要求书

1.IL-6R抑制剂及IL-4R抑制剂联合用药在乳腺癌化疗药物的中的应用，其特征在于：所述乳腺癌化疗药物为顺铂。

2.根据权利要求1所述的多肽类似物在治疗乳腺癌药物的中的应用，其特征在于：IL-6R抑制剂为细胞介素-6（IL-6）受体抑制剂，IL-4R抑制剂为白介素-4（IL-4）受体抑制剂，IL-4参与促进巨噬细胞M2极化，IL-6是一种功能广泛的多效性细胞因子，两者都参与调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用；在肿瘤微环境中，IL-4和IL-6参与促进巨噬细胞极化，在肿瘤发展晚期两者协同作用，促进巨噬细胞M2极化，具有抗炎作用。

3.根据权利要求1所述多肽类似物在治疗乳腺癌药物的中的应用，其特征在于，具体步骤为：

第一步，建立体外乳腺癌细胞和巨噬细胞共培养体系模拟人体内环境：其中乳腺癌细胞选用的是MDA-MB-468细胞，巨噬细胞选用的是人单核细胞THP-1；

第二步，研究IL-6R抑制剂与IL-4R抑制剂联合使用在乳腺癌化疗药物中效果：IL-4 /IL-6协同诱导靶基因的体外验证；

第三步：单独或联合使用IL-4和IL-6处理24小时的巨噬细胞中指示基因的mRNA表达分析；

第四步：IL-6和IL-4的双重刺激增强了IL-4靶向的趋化因子如CCL17、CCL18、CCL23和CCL8的表达；

第五步：使用Trizol法抽提巨噬细胞中总RNA，每个样品中加入1mlTrizol，转移入离心管；

第六步：按每毫升Trizol加入200微升的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置十分钟；

第七步：然后，在四摄氏度12000g离心十五分钟，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升Trizol加入0.6ml异戊醇，混匀放置室温5-10分钟；

第八步，然后，在四摄氏度12000g离心十分钟，弃上清液，按每毫升Trizol加入1ml的75%乙醇，温和振荡，悬浮沉淀；

第九步：然后，在室温晾干或真空干燥5-10min，再测260nm下吸光值定量RNA浓度；

第十步：利用cDNA试剂盒反转录；

第十一步：使用Bio-Rad的CFX96系统和iQ SYBR green Supermix（Bio-Rad）进行实时定量PCR，内参为β-actin；

第十二步：在后续的实验用分别用IL-6R和IL-4R抑制剂处理巨噬细胞，中IL-6R抑制剂为托珠单抗，使用浓度为200μg/ mL；IL-4R抑制剂为dupilumab，使用浓度为1500μg/ mL；

第十三步，在巨噬细胞Thp-1与乳腺癌细胞MDA-MB-468共培养的过程中，Thp-1细胞在上层，MDA-MB-468在下层，在上层加入两种抑制剂达到先处理Thp-1的目的与乳腺癌细胞即MDA-MB-468细胞共培养：其中巨噬细胞在上层，MDA-MB-468细胞在下层，中间用0.4μm的PET膜分隔开，保证细胞因子可以通过，而细胞不能通过，之后用流氏检测肿瘤细胞的凋亡情况；

第十四步，细胞收集： Thp-1悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为5×10⁶/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液；

第十五步：用孵育缓冲液即PBS缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min；

第十六步：用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min，所述标记溶液为SA-FLOUS标记溶液；

第十七步：1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液即PBS缓冲液洗1次；

第十八步：加入荧光SA-FLOUS溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动；

第十九步：流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI；

第二十步：结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能；细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生；因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号；正常活细胞与此相似；

第二十一步，研究IL-6和IL-4R抑制剂联合使用的作用，设计实验验证IL-6R抑制剂联合IL-4R抑制剂是否降低了乳腺癌细胞系的致瘤性：在裸鼠背部皮下注射分别用IL-6R抑制剂或IL-4R抑制剂培养过的MDA-MB-231细胞，10-14天后，用于实验的12只裸鼠在接种部位的发生均生长出可触及的皮下肿瘤，之后开始用药处理，药物选用的顺铂，在开始用药前，针对野生型，即未处理的MDA-MB-468细胞裸鼠皮下瘤模型，确定了顺铂的用药浓度及用药时长，最后选用的顺铂的用药处理方式为：每千克kg的裸鼠给药4mg，生理盐水溶解顺铂粉末，腹腔注射，每5日给一次药；在联合使用组，肿瘤体积结果显示，对于肿瘤的抑制作用联合处理组肿瘤体积显著低于其他组（p0.01），提示联合用药对于乳腺癌治疗作用意义；以上各组用药对体重没有明显影响，表明处理未对小鼠产生毒性。