[发明专利]基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置

权利要求书

1.一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发，形成4Pi照明；

2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后，同样经过50％分束镜分束后通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

3)样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经过二向色镜后被工业相机采集；

4)通过电光调制器移动损耗光图样，对照明范围内的样品进行扫描，工业相机相应采集到一组图像；

5)对获得的图像组中的每张图像分别进行对应的针孔滤波再将其叠加在一起，获得该轴向位置下的高轴向分辨率的二维超分辨图像；

6)对样品进行三维扫描时，保持样品上下两个显微物镜位置不变，即显微物镜的聚焦位置不变，仅通过压电调整平台平移样品进而改变显微镜扫描的样品薄层，通过层切的方法还原样品的三维结构。

2.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤1)中，激光经过50％分束镜后分成强度完全相同的两束光，透射路经由第一反射镜、第二反射镜和样品上方的第一显微物镜后照射在压电调整平台上的样品上；反射路经由第三反射镜、第四反射镜和样品下方的第二显微物镜后照射在压电调整平台上的样品上；透射路和反射路到样品的光程严格相等。

3.根据权利要求2所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤2)中，并行受激发射损耗显微损耗模块产生的损耗图样通过50％分束镜分成完全相同的两个图样，透射路经由第一反射镜、第二反射镜和第一显微物镜；反射路经由第三反射镜、第四反射镜和第二显微物镜；透射路和反射路到样品的光程严格相等，两路光照射在样品上分别形成两个完全相同的损耗图样。

4.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。

5.一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：照明光激光器、损耗光激光器、并行受激发射损耗显微损耗模块、二向色镜、50％分束镜、若干反射镜、两个显微物镜、滤光片、成像透镜和工业相机；

所述并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生并行损耗光图样，其使用电光调制器移相；

所述照明光激光器产生宽场光，通过50％分束镜分成强度完全相同的两束光，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发；

所述损耗光激光产生激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块，并行受激发射损耗显微损耗模块产生并行的损耗光图样，通过50％分束镜分成完全相同的两个图样，通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

两个显微物镜分别采集样品发出的荧光，通过照明光原光路返回，两束光在50％分束镜合束，经二向色镜、滤光片、成像透镜后照射在工业相机上。

6.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生阵列的甜甜圈形损耗图案，实现方式包括：是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。

7.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述显微物镜用于最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，数值孔径NA需大于等于1.49。

8.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，由于要求两个显微物镜的照明光程严格相等，聚焦位置也不发生改变，在实验过程中不能移动两个显微物镜，对样品的层切通过压电调整平台进行调整。

9.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，放置的样品载玻片和盖玻片均是透明的，调整时使上下光路等光程。