[发明专利]基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置

说明书

本发明公开了一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置，该方法包括：照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜通过样品上下的两个显微物镜对样品进行照明激发；损耗光激光器产生激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行损耗光图样后，经过50％分束镜通过样品上下的两个显微物镜投射在样品表面；样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经二向色镜后被工业相机采集；本发明通过双物镜照明的方式，使用4Pi技术提高成像图片的轴向分辨率；虽然获得样品全部的三维信息需要通过层切实现，但是由于二维图像成像速度极快，提高了系统总体的成像速度，并且对可观测的样品深度无限制。

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于并行受激发射损耗显微镜(STED)和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜是生命科学等领域用于观察研究微观结构的重要手段。但是由于光的衍射效应，光学系统的有限孔径限制了普通光学显微镜的分辨率，无法对尺寸小于半波长的样品进行准确观测，这极大的阻碍了生命科学的发展。

为了突破这个限制，科学家们提出了多种超分辨成像技术方法，来实现对纳米级的微小结构的观察研究。单分子定位技术，包括随机光学重构显微镜和光激活定位显微镜，通过对视野内的分子逐个定位实现分辨率的突破，所以具有因为成像速度慢而无法观测分子动态的缺点，并且对样品表现出较大的光毒性，很难观测活细胞。结构光照明显微镜则使用余弦条纹进行照明，通过调制样品的空间频率来采集包含样品细节的高频信息，再通过已知的照明条纹进行后期算法还原，来实现超分辨率成像。结构光照明显微镜入射光功率低不易漂白，但是其分辨率相对受限。

受激发射损耗显微术则是通过损耗光使部分被激发的荧光分子受激辐射而猝灭，通过控制损耗光的空洞来降低自发辐射的荧光点扩散函数的宽度，进而实现超分辨率显微成像。虽然技术使用的高功率的损耗光有一定的光毒性，但是相比单分子定位技术，它在成像速度上有着显著的优势，分辨率相较结构光照明显微镜又有较大的提升。

但是受激发射损耗显微镜的高速成像依赖于标记密集的标本、相对较低的空间分辨率和相当小的视野。所以快速点扫描通常需要高重复率激光器，这会增强样品的光漂白和光损伤。所以科学家们在这基础上引入了并行受激发射损耗显微镜，可以在同样的扫描域和分辨率下以倍数降低扫描时间，进而实现大视野下低光损伤的快速扫描。然而这种情况只适用于二维扫描，只能获取样品的横向分布信息，而无法得到准确的轴向结构信息。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于并行受激发射损耗显微镜和4Pi技术的三维超分辨显微成像方法和装置，可实现较大厚度样品的三维超分辨显微成像。

为了实现上述目的，本发明提供的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发，形成4Pi照明；

2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后，同样经过50％分束镜分束后通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

3)样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经过二向色镜后被工业相机采集；

4)通过电光调制器移动损耗光图样，对照明范围内的样品进行扫描，工业相机相应采集到一组图像；

5)对获得的图像组中的每张图像分别进行对应的针孔滤波再将其叠加在一起，获得该轴向位置下的高轴向分辨率的二维超分辨图像；

6)对样品进行三维扫描时，保持样品上下两个显微物镜位置不变，即显微物镜的聚焦位置不变，仅通过压电调整平台平移样品进而改变显微镜扫描的样品薄层，通过层切的方法还原样品的三维结构。