[发明专利]源自鸡蛋的热启动酶及阻断活性的评价方法在审
申请号: | 202010964397.1 | 申请日: | 2020-09-15 |
公开(公告)号: | CN112063600A | 公开(公告)日: | 2020-12-11 |
发明(设计)人: | 乌拉迪斯拉夫 | 申请(专利权)人: | 诸暨加向生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N9/12 | 分类号: | C12N9/12;C07K16/40;C07K16/02;C12Q1/686;C12Q1/6804;C12Q1/70;C12R1/93 |
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地址: | 311800 浙江省绍兴市诸暨*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 源自 鸡蛋 启动 阻断 活性 评价 方法 | ||
1.一种源自鸡蛋的热启动酶,其特征在于:所述的热启动酶,包括Taq 聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。
2.一种根据权利要求1所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法:
步骤一:将两只20周大的母鸡关在笼子里,进食和饮水,用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中进行混合,形成混合液,混合液在相同体积的弗氏完全佐剂(FCA)中乳化,用于首次针对母鸡注射,而后混合液在相同体积的弗氏不完全佐剂(FIA)中乳化又进行两次注射,实现免疫接种;
步骤二:每隔10天进行步骤一条件下的注射;
步骤三:在3个月内每月进行一次弗氏不完全佐剂(FIA)的免疫接种,每天收集鸡蛋;
步骤四:完成步骤三的鸡蛋黄中分离IgY的第一步涉及从脂质和脂蛋白中提取可溶性蛋白,该方案包括在0.1%(w / v)的柑橘果胶水溶液中通过5倍稀释的蛋黄沉淀不溶物;
步骤五:通过用35%(w / v)硫酸铵混合经过步骤一的蛋黄沉淀不溶物,饱和沉淀出水溶性蛋白质(包括IgY)
步骤六:为了亲和步骤二的水溶性蛋白质,以琼脂糖凝胶4B为基质,以Taq聚合酶作为配体相结,获得热启动酶。
3.一种根据权利要求2所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法:以0.1 ml / min的流速将总水溶性蛋白质在PBS中稀释至1.0 mg / ml,并加到在磷酸缓冲盐溶液中平衡的以琼脂糖凝胶4B为基质的Taq聚合酶形成的亲和树脂,直到流槽A280的光密度达到基本水平,获得热启动酶。
4.一种根据权利要求3所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法:用0.1 M甘氨酸缓冲液(pH2.3)洗脱结合的热启动酶并分离,加入相同体积的0.2 M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中和洗脱的热启动酶,合并洗脱的分离,并在磷酸缓冲盐溶液中透析过夜获得热启动酶。
5.一种根据权利要求1至2任一所述源自鸡蛋的热启动酶阻断活性的评价方法:
步骤一:配制两种预混液:热启动酶 PCR预混液和逆转录抗体PCR预混液,每个预混液均包含Taq聚合酶缓冲液,Taq聚合酶缓冲液包括50 mM Tris-HCl,pH 9.9,50 mM KCl,3 mMMgCl2,1 mM DTT,1 mM EDTA,将两种预混液用5%海藻糖和0.5%聚乙二醇作为冷冻保护添加剂冻干;
步骤二:使用从疫苗菌株中分离出总猪瘟病毒,逆转录抗体 PCR预混液首先使用来自鼠白血病逆转录酶和随机六聚体引物3μg在Taq缓冲液中于42℃进行20分钟的逆转录PCR 5μl猪瘟病毒(20 ng),然后在95℃失活10分钟,使用以下循环条件:95℃ 2分钟;在20μl热启动酶主混合物中扩增5μlcDNA(1000、250和62个拷贝),进行40个循环,40个循环包括95℃热启动持续10 s和58℃持续20 s,在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm,并记录数据;
步骤三:对于热启动酶 PCR预混液,将5μl猪瘟病毒直接加入一管抗体PCR Master Mix中,并在以下条件下运行:42 ℃进行20分钟; 95 ℃ 2分钟; 40个循环包括95 ℃持续10 s和58 ℃持续20 s,在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm,并记录数据。
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