[发明专利]源自鸡蛋的热启动酶及阻断活性的评价方法

说明书

本发明公开了一种源自鸡蛋的热启动酶及其阻断活性的方法，所述的热启动酶，包括Taq聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。本发明选择衍生自鸡蛋的多克隆抗体IgY结合Taq聚合酶，实现了对于热启动IgY不会抑制聚合酶活性，而是可逆地阻止它，且价格低廉，适于大面积推广。

技术领域

本发明涉及一种源自鸡蛋的热启动酶及其阻断活性的评价方法。

背景技术

热启动可以大大提高PCR的特异性，灵敏度和产率。在室温下制备反应混合物时，PCR中会发生非特异性扩增，因为Taq聚合酶具有活性，引物可以非特异性杂交。 热启动Taq聚合酶在室温下保持无活性，并在95°C加热后被激活，从而防止了非特异性扩增。 针对Taq聚合酶的单克隆抗体是用于将常规Taq聚合酶打开为热启动试剂的第一线试剂。

蛋黄衍生的抗体（IgY）是众所周知的最便宜的来源，其质量与哺乳动物IgG抗体相同，并且比过去有一些突出的优势。 与IgY的开发和使用相关的这些优势包括对哺乳动物抗原的更好的免疫应答，与持续效价的更高亲和力，无创采样，简单且低成本的分离过程，高产量和可扩展的生产性。 自1996年以来，IgY技术已成为描述IgY生产和使用的国际公认术语。 欧洲替代方法验证中心（ECVAM）研讨会建议使用IgY代替哺乳动物IgG，以最大程度地减少有创抗体采样引起的痛苦，并促进鸡IgY的更广泛实施，因为这种方法满足了科学和商业利益 以及对动物福利的关注。

Taq DNA聚合酶的单克隆抗体是聚合酶链反应（PCR）中的核心酶，在环境温度下会使其失活。 在随后的加热中，反应混合物引起聚合酶的活化，并且扩增以特定且有效的方式进行。 这就是抗体介导的所谓热启动PCR。 对于复杂DNA背景中低拷贝数模板的可靠检测，它尤其有用。 但是最近的研究表明，许多商业上以“热启动”形式销售的Taq酶制剂在热激活之前就表现出聚合酶活性。 许多热启动酶不能按预期发挥作用具有深远的意义。

如何生产和评估一种价格低廉、有效的热启动酶是本领域技术人员研究的对象。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，通过使用单克隆抗体作为热启动试剂来解决上述问题，并提出研究使用多克隆抗体的可行性。 选择的模型是衍生自鸡蛋的多克隆抗体IgY。

一种源自鸡蛋的热启动酶，所述的热启动酶，包括Taq 聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。

一种源自鸡蛋的热启动酶制备方法：

步骤一：将两只20周大的母鸡关在笼子里，进食和饮水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中进行混合，形成混合液，混合液在相同体积的弗氏完全佐剂（FCA）中乳化，用于首次针对母鸡注射，而后混合液在相同体积的弗氏不完全佐剂（FIA）中乳化又进行两次注射，实现免疫接种；

步骤二：每隔10天进行步骤一条件下的注射；

步骤三：在3个月内每月进行一次弗氏不完全佐剂（FIA）的免疫接种，每天收集鸡蛋；

步骤四：完成步骤三的鸡蛋黄中分离IgY的第一步涉及从脂质和脂蛋白中提取可溶性蛋白，该方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果胶水溶液中通过5倍稀释的蛋黄沉淀不溶物；

步骤五：通过用35％（w / v）硫酸铵混合经过步骤一的蛋黄沉淀不溶物，饱和沉淀出水溶性蛋白质（包括IgY）

步骤六：为了亲和步骤二的水溶性蛋白质，以琼脂糖凝胶4B为基质，以Taq聚合酶作为配体相结，获得热启动酶。

作为优选方法，以0.1 ml / min的流速将总水溶性蛋白质在PBS中稀释至1.0 mg/ ml，并加到在磷酸缓冲盐溶液中平衡的以琼脂糖凝胶4B为基质的Taq聚合酶形成的亲和树脂，直到流槽A280的光密度达到基本水平，获得热启动酶。