[发明专利]产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用

权利要求书

1.一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，其特征在于，包含18S rDNA基因片段-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列(GAP-p)-漆酶基因-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子序列(GAP-t)-放线菌酮(CYH)抗性基因。

2.根据权利要求1所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，其特征在于，所述漆酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，

(1)漆酶(Lac)基因的克隆：提取云芝栓孔菌中总RNA，以提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得目的基因并与pMD19-T载体连接，转化提取，得到重组质粒；

(2)酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)GAP-p GAP-t基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得酵母GAP启动子(GAP-p)片段、GAP终止子(GAP-t)片段，将目的片段GAP-p、GAP-t分别连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-GP、pT-GT，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(3)放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)CYH敏感基因(L41)序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，及一对反向互补引物；以产朊假丝酵母基因组为模板,PCR扩增出L41上游片段、下游片段,这2片段的一端具有碱基重叠区；以这两上游片段、下游片段等量混合为模板,进行套叠PCR,即获得CYH抗性基因；将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-CYH，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(4)18S rDNA基因片段的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)18SrDNA基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得18S rDNA片段，将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上获得质粒载体pT-rD，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(5)同源整合表达载体的构建：提取pT-GP、pT-GT和pBR322质粒,分别进行酶切,回收目的片段，用T4 DNA连接酶将这3片段同时连接,获得质粒pBR-GAP；提取pT-CYH和pBR-GAP质粒,分别进行酶切，回收目的片段,用T4 DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-L；提取pBR-G-L质粒和漆酶(Lac)基因重组质粒，分别进行酶切，回收目的片段,用T4 DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-Q-L；提取pT-rD和pGQL质粒，分别进行酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接,获得产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR。

4.根据权利要求3所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，所述酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆中，引物设计如下：

启动子(GAP-p)：

GAP-p1:GGATATCTTACAGCGAGCACTCAA；

GAP-p2:GCTCTAGAATGTTGTTTGT；

终止子(GAP-t)：

GAP-t1：CTAGCTAGCTATGACTTTTAT；

GAP-t2：GGGATCCTTCATTCATCCCTCACTATCG。