[发明专利]产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用

说明书

本发明提供一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用。产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，包含18S rDNA基因片段‑酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列(GAP‑p)‑漆酶基因‑酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子序列(GAP‑t)‑放线菌酮(CYH)抗性基因。本发明整个表达系统的全部遗传元件均来自益生菌产朊假丝酵母和无毒无害的真菌，不携带抗生素抗性基因，不存在抗性基因的漂移、扩散及整合，也不携带其他有毒蛋白基因，不会对环境或人和动物带来生物安全性的危害，达到了食品级，可直接添加到食品、药物和饲料中应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用。

背景技术

内蒙古有着丰富的秸秆资源，全区年产各类农作物秸秆达35亿公斤，相当于全区天然草原打草量的2倍。当前绝大多数秸秆还是以简单的粉碎、压成颗粒及青贮制作方式饲喂家畜。奶牛对简单加工玉米秸秆中的干物质(DM)的表观消化率为63.38﹪，中性洗涤纤维(NDF)的表观消化率为62.06﹪，酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率为50.36﹪。肉牛对简单粉碎小麦秸秆中的中性洗涤纤维的表观消化率为56.87﹪，酸性洗涤纤维的表观消化率为49.04﹪。就是说秸秆饲料饲喂当中，至少有近37﹪的干物质、38﹪～46﹪的中性洗涤纤维、49﹪～51﹪酸性洗涤纤维经粪便流失掉。我国玉米的种植面积持续增涨较快，在玉米产量提升的同时，产生大量的玉米秸秆，但是仅有不到20％的玉米秸秆被有效加工。所以，攻克秸秆饲料消化利用率的关键技术是解决我区畜牧业生产中粗饲料资源不足和利用率低，降低养殖成本，提高牛、羊饲养数量和养殖经济效益的有效途径。

由于秸秆营养成分利用率低,适口性差，利用价值不高,每年都有大量秸秆直接还田或焚烧,用作饲料的仅占一小部分,这不仅造成资源浪费,而且焚烧还污染环境。造成农作物秸秆用作饲草利用率低的原因之一是：随着农作物的成熟，木质化程度也越高，秸秆细胞壁中木质素含量也增加。

木质素的基本结构单元是苯丙烷，通过醚键和碳碳键连接形成复杂的无定形高聚物。典型木质素是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇这3种不同的醇作为先体物质组成基本结构。木质素能与半纤维素分子紧密交联形成疏水的网状结构，整个细胞壁就成为一个紧密的网状，增加了细胞壁的机械强度和对微生物的抵抗能力。与此同时，也阻碍了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素接触，从而降低纤维多糖的降解效率。因此木质素被认为是抑制秸秆利用率的主要限制性因素。玉米秸秆中木质素含量可达到19％～23％，直接影响玉米秸秆的利用效率。原因之二是：目前已开发应用的酸处理、碱处理、蒸汽爆破、热水处理、氨纤维爆炸、挤出预处理、微波预处理等，虽然这些预处理方法提高了秸秆利用率，但是其高昂的设备费用使秸秆在实际应用中受到制约。

到目前为止，仅有少数微生物可以降解木质素，其中绝大部分是真菌，少数是细菌，但是后者仅有较弱的木质素降解能力。由于白腐真菌能高效地选择性降解木质素，因此被认为是去除木质素最有应用前景的一大类真菌。已知白腐真菌分泌木质素降解有关的几类主要过氧化物酶：漆酶(Laccase；EC 1.10.3.2)，锰过氧化物酶(MnP；EC 1.11.1.13)(这两个酶首先在黄孢原毛平革菌中发现)，多功能过氧化物酶(在杏鲍菇中首先发现)，木质素过氧化物酶(LiP；EC 1.11.1.14)和多种辅助酶。一些白腐菌产生上述中的3种分解木质素的酶，而大多数白腐菌仅产生2种甚至1种分解木质素的酶，因此表明上述4种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的。研究表明，木质素过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶都能与低分子量的中介体共同作用，即酶产生具有攻击木质素结构能力的反应中间产物，间接地引起木质素的氧化反应，从而导致木质素的分解，这已被提出作为木质素的降解机制。