[发明专利]基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体；

所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体由如下方法制备而成：

将NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第一产物；

将第一产物用过量的半胱氨酸盐酸盐与氰基硼氢化钠处理，使醛基与半胱氨酸盐酸盐发生醛胺缩合反应，抗体Fc端生成有活性的巯基；

将碱性磷酸酶用SMCC处理，暴露出有活性的马来酰胺基团；然后与Fc端生成有活性巯基的NT-proBNP检测抗体混合，使巯基与马来酰胺反应生成稳定的硫醚键；再用NEM溶液封闭反应，除盐，制备得到碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体；

所述磁珠包被的NT-proBNP包被抗体由如下方法制备而成：

将NT-proBNP包被抗体与高碘酸钠反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第二产物；

将第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应，酰肼基团与醛基反应生成稳定的腙键，使抗体的Fc端修饰上生物素；

将链霉亲和素修饰的磁珠与Fc端修饰有生物素的NT-proBNP包被抗体混合，生物素与链霉亲和素反应生成稳定的共价键，即制备得到磁珠包被的NT-proBNP包被抗体。

2.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠反应具体为：将NT-proBNP检测抗体溶于buffer 1中，加入初始浓度为200mM的高碘酸钠溶液，4-6℃反应1h；

所述NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠溶液加入量的比为5mg：(100-120)μL；

所述buffer 1为pH8.0的0.1M TEA缓冲液，含0.16M NaCl。

3.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述醛胺缩合反应具体为：向第一产物中加入初始浓度为0.75M的半胱氨酸盐酸盐和0.3M的氰基硼氢化钠，室温反应过夜。

4.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶用SMCC处理具体为：将碱性磷酸酶溶于buffer 3中，加入初始浓度为3.7mg/mL的SMCC溶液，室温反应30min；

所述buffer 3为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl、1mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂。

5.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶为高比活力碱性磷酸酶CmAP。

6.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应具体为：向第二产物中加入初始浓度为50mM的生物素-LC-酰肼试剂，室温反应2h。

7.根据权利要求1-6任一项所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述NT-proBNP检测试剂盒还包括：底物、反应液和清洗液。

8.根据权利要求7所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述底物为AMPPD；所述反应液为pH＝10.3的4M DEA缓冲液，含20mM MgCl₂；所述清洗液为pH＝7.4的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1％BSA、0.05％NaN₃、0.1％Proclin和0.05％Tween-20。