[发明专利]基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT‑proBNP检测试剂盒及其应用，属于免疫化学检测技术领域。本发明对酶‑抗体以及磁珠‑抗体的连接方法进行了优化，大大降低了酶和磁珠对抗原‑抗体之间结合的影响，极大提高了检测灵敏度；同时采用比活力更高的碱性磷酸酶CmAP代替现有商品化的碱性磷酸酶BIAP，使检测的灵敏度得到进一步的提高。为心力衰竭的早期诊断和治疗提供更及时、可靠的信息。

技术领域

本发明涉及免疫化学检测技术领域，具体涉及一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用。

背景技术

心力衰竭是当前一种复杂的症候群，是冠心病病情发生和发展的最终结果，临床表现是呼吸困难，水肿和无力而致体力活动受限等，预后较差，其死亡率较高。据国内相关调查，心力衰竭住院率虽然相对不高，只为同期心血管疾病的20％，但是死亡率却为40％，并且患者的预后较差。因此，早期诊断及时治疗对改善心力衰竭患者的预后具有重要意义。B型钠尿肽(BNP)在心室容积扩张和压力负荷增加时升高，能敏感而特异地反映左心功能的变化。在血浆中N氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)分子与BNP分子以1：1的比例存在于血循环中，其比BNP更稳定，可以此反映心室功能的变化。

目前世界上针对NT-proBNP的主流检测方法为化学发光免疫分析法(CLIA)。将碱性磷酸酶(ALP)或吖啶酯结合的单克隆抗NT-proBNP检测抗体，连同含缓冲液的表面活性剂和样本，加入到反应容器中。在短时间孵育后，加入包被有NT-proBNP检测抗体的磁性微粒(MPs)。NT-proBNP抗原在固相上与NT-proBNP抗体结合，同时ALP或吖啶酯标记的NT-proBNP检测抗体和NT-proBNP抗原分子上不同抗原位点反应。在反应管内孵育完成后，结合在固相上的物质将置于一个磁场内被吸住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物AMPPD(针对ALP标记)或H₂O₂(针对吖啶酯标记)添加到反应管中，由化学发光检测仪对反应中产生的光进行测量。发光量与样本中NT-proBNP的浓度成正比。样本内分析物的量由多点校准曲线来确定。

基于ALP-AMPPD(ALP是碱性磷酸酶的缩写，AMPPD是1,2-二氧环乙烷衍生物，是一种超灵敏的ALP发光底物)的检测体系是当前应用最为广泛的化学发光免疫分析方法之一，具有灵敏度高、操作简单、发光时间长等优势。其检测灵敏度的高低主要取决于以下几个因素：(1)化学发光检测仪灵敏度的高低；(2)抗原和抗体的特异性结合能力的强弱，可以筛选针对某些特定抗原表位的高特异性单克隆抗体；(3)酶标抗体中ALP比活力的高低。酶的比活力越高，催化相同底物反应生成发光产物需要的酶分子数越少，相应可检测的抗原量就越低。

专利CN107656071A公开了一种NT-proBNP检测试剂盒，其利用Sulfo-SMCC活化碱性磷酸酶，Traut′s试剂修饰NT-proBNP抗体，使NT-proBNP抗体上带有能够与活化的碱性磷酸酶相结合的巯基，通过巯基与氨基的结合，实现抗体与酶的偶联；通过采用NHS和EDC活化磁珠，提高了NT-proBNP抗体与磁珠的偶联效率；通过碱性磷酸酶标记的NT-proBNP抗体和NT-proBNP抗体标记的磁珠与待测样本中的NT-proBNP抗原的不同表位结合，然后加入与酶促化学发光底物，利用对发光强度的检测，实现对待测样本中的NT-proBNP含量的准确测定。但该方法利用Traut′s试剂与抗体表面氨基反应生成巯基，抗体表面的氨基可能在Fab端，这样带来的负面影响是酶与抗体可变区连接，影响抗体和抗原之间的结合，降低了与抗原结合的效率，进而降低了检测的灵敏度。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用。本发明对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法进行了优化，大大降低了酶和磁珠对抗原-抗体之间结合的影响，极大提高了检测灵敏度；同时采用比活力更高的碱性磷酸酶CmAP代替现有商品化的碱性磷酸酶BIAP，使检测的灵敏度得到进一步的提高。