[发明专利]一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法

权利要求书

1.一种从有毒贝壳中提取新石 房蛤毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、肝胰粉制备

从有毒贝壳中取出肝胰，沥水、冻干、均质混匀后得到肝胰粉，将体积与肝胰粉质量比为2～3的除杂溶剂与肝胰粉混匀，超声处理并过滤后，将肝胰粉烘干、均质；

B、毒素粗提

将肝胰粉与水以质量体积比为1:2的比例混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，置于100℃水浴加热15～30min，超声提取10～20min后于3000～4000r/min离心6～10min，取上清后，于30～60℃水浴旋转蒸发至近干，去离子水溶液残留物，获得毒素粗提溶液；

C、净化

采用葡聚糖凝胶层析柱对毒素粗提溶液进行净化，将毒素粗提溶液于8000～10000r/min离心4～7min，取其上清液过凝胶柱进行层析净化；先以200倍体积的去离子水洗脱，流速0.5～0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，自动馏分收集器收集馏分，设置每管收集时间为15min，同时将每管收集液取一部分过0.22μm滤膜于进样小瓶中，进LC-MS/MS分析；收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后将其合并、30～40℃减压蒸馏浓缩近干；

D、分离纯化：

将步骤C收集的样品溶解于含0.1％甲酸的20％乙腈溶液中，采用配有光电二极管阵列检测器的液相色谱进行分离、纯化，根据目标物保留时间收集色谱峰，连续制备合并馏分，30～40℃减压蒸馏浓缩近干，用含0.1％甲酸的75％乙腈水溶解，保存于-40℃冰箱中。

2.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：

其中，有毒贝壳包括有毒扇贝或贻贝。

3.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：

其中，步骤A中，从有毒贝壳中取出肝胰后，先在筛子上平铺沥水5min，冻干后采用组织均质器以12000r/min进行均质、混匀得到肝胰粉；

所述除杂溶剂为石油醚或正己烷，其体积与肝胰粉的质量比为2.5，混匀并超声处理10min后过滤，完成除杂。

4.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：

其中，步骤B中，所采用的酸提取液为1％乙酸或0.5％甲酸。

5.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：

其中，步骤C中，葡聚糖凝胶层析柱选用5cm I.D.×30cm，取干重80克胶体粉末浸泡于去离子水中，使其充分浸润膨胀，脱气后充填，然后以去离子水预洗10h，流速1mL/min。

6.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：

其中，步骤D中，采用TSK-GELHillicAmide-80色谱柱进行制备，尺寸规格为4.6mm×250mm，5.0μm，进样50μL，每针制备时间为20min。