[发明专利]一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法

说明书

本发明涉及一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，包括A、肝胰粉制备；B、毒素粗提：将肝胰粉先与水混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，依次进行水浴加热、超声提取、离心取上清、50～60℃水浴旋转蒸发获得毒素粗提溶液；C、净化：采用葡聚糖凝胶层析柱进行净化，毒素粗提溶液离心取上清过凝胶柱，先以200倍体积的去离子水洗脱，流速0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后合并、浓缩近干；D、分离纯化：将步骤C收集的样品溶解，采用液相色谱进行分离、纯化，根据目标物保留时间收集色谱峰，合并馏分，浓缩，用含0.1％甲酸的75％乙腈水溶解，保存于‑40℃冰箱中。

技术领域

本发明属于海洋生物毒素制备技术领域，具体涉及一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法。

背景技术

麻痹性贝类毒素由石房蛤毒素(Saxiotixn,STX)及其衍生物组成，STX是目前发现的非蛋白有机小分子中毒性最强的毒素之一，其毒性是氰化钾的1500倍。由于麻痹性贝类毒素毒性高、具不可预见性且在全球广泛分布，多次引发消费者中毒甚至死亡事件。因此，欧盟、美国、加拿大等多个国家或地区对其制定了严格的限量标准并加以监控。然而，毒素检测技术作为监控的必要手段，受麻痹性贝类毒素标准品的匮乏的影响，而受到了诸多限制。此外，麻痹性贝类毒素在赤潮研究、工具药、医学、军事等方面都有潜在的用途。

目前，以加拿大国家海洋研究所为首的科研机构致力于贝类毒素有证标准物质的研发，目前已经建立了较为完善的贝类毒素分离纯化方法，并研制出20余种贝类毒素纯度标准物质，但由于对商业机密的保护，有关麻痹性贝类毒素分离纯化的详细方法少有公开。目前中国市场中尚无自主研发的麻痹性贝类毒素标准样品，在相关检测与科研工作中使用的麻痹性贝类毒素标准样品均购自加拿大国家海洋研究所，不仅存在到货周期长、价格昂贵、受出入境严格限制等问题，且无法保证运输过程中样品的稳定性。因此，获得自主开发的麻痹性贝类毒素成为目前国内市场的迫切需求。

新石房蛤毒素(neoSTX)是麻痹性贝类毒素众多衍生化合物之一，其毒性因子可达0.92，属于麻痹性贝类毒素中高毒性化合物。此外，在麻痹性贝类毒素的日常监测中，neoSTX阳性率高，较易引发中毒事件。目前，尚未见有关从有毒扇贝中提取neoSTX的相关报道。

因此，开发一种从有毒扇贝中提取新石房蛤毒素(neoSTX)的制备技术，获得neoSTX纯品，满足麻痹性贝类毒素化学检测方法中毒素质量分析的要求实属必要。

发明内容

本发明是为解决上述不足进行的，以有毒扇贝作为毒素来源，提供了一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，包括如下四道工序：

A、肝胰粉制备

从有毒贝壳中取出肝胰，沥水、冻干、均质混匀后得到肝胰粉，将体积与肝胰粉质量比为2～3的除杂溶剂与肝胰粉混匀，超声处理并过滤后，去除脂溶性杂质，而后将肝胰粉烘干、均质。

B、毒素粗提

将肝胰粉与水以质量体积比为1:2的比例混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，置于100℃水浴加热15～30min，超声提取10～20min后于3000～4000r/min离心6～10min，取上清后，于50～60℃水浴旋转蒸发至近干，去离子水溶液残留物，获得毒素粗提溶液。本步骤中，先将肝胰粉与水进行预混合，有助于提高neoSTX的提取效率。

C、净化