[发明专利]一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的方法

说明书

本发明公开了一种基于多重PCR方法快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10‑6转化体特异性的方法，该方法以转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的G2‑epsps和GAT外源插入基因序列设计合成特异性引物，通过引物浓度优化组合，构建转化体特异性鉴定多重PCR反应体系。本发明针对转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的外源插入序列的独特表达方式（插入了两个重复的G2‑epsps基因和一个GAT基因，形成了2个表达框和4个边界）设计了4对转化体特异性序列，引入大豆内源Lectin基因构建五重PCR反应体系，为基于外源目的基因的转基因转化体特异性鉴定提供了一种经济高效、准确可靠的高通量的技术手段。

技术领域

本发明属于农业转基因生物安全评价技术领域，特别是涉及一种转基因耐除草剂大豆转化体特异性多重PCR方法构建及其应用。

背景技术

随着转基因作物的商业化种植，转基因作物的安全性以及对人类健康和生态环境的潜在威胁倍受广大民众的广泛关注。我国农业部发布的“转基因植物安全评价指南”，为我国农业转基因生物安全评价提供了技术支撑。其中分子特征是转基因植物安全评价的重要组成部分，指转基因植物中外源DNA 片段在受体基因组中的整合、表达以及遗传稳定性等方面的信息，是建立转基因植物精准检测技术的依据。

目前，我国针对转基因植物安全评价的分子特征鉴定已建立了多种检测方法。蛋白质水平检测方法主要包括试纸条法、酶联免疫吸附法和生物传感器法；核酸水平检测方法主要包括普通PCR、实时荧光PCR 和环介导等温扩增PCR技术等。而多重PCR即复合PCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR)可在一个反应体系内同时检测多个转基因成分，并且可以在一次反应中检测多个品系的转基因成分，相对于普通PCR 技术是一种经济、高效的检测手段，逐渐在转基因植物的分子特征鉴定中得到应用。尹全等根据抗草甘膦大豆MON89788分子特征，建立了除内源基因在外的3种外源基因的复合PCR检测体系；董立明等针对目前国内外已商品化应用最为广泛的5种转基因大豆建立了转基因大豆品系的六重PCR 检测技术，其检测灵敏度为0.1 %。

转基因耐草甘膦大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研究的转G2-epsps基因和GAT基因的耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有两个重复的G2-epsps基因和一个GAT基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，然后利用G2-EPSPS基因和GAT基因整合在受体基因组不同位置上的特性，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在我国具有重要产业化应用前景。目前还没有关于ZH10-6分子特征的检测方法研究的报道，本研究通过利用复合PCR技术检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性的鉴定方法，为该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明提供了一种转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征转化体特异性多重PCR鉴定方法。本发明的鉴定方法具有高效、快速、经济、操作简便等优势。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物，其特征在于包括ZH10A（边界A）：

引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’ SEQ ID NO:1

反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’ SEQ ID NO:2

ZH10B（边界B）：