[发明专利]测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法

权利要求书

1.测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；

(2)将步骤(1)中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有香豆素、安非他酮、阿莫地喹和右美沙芬四种特异探针底物的孵育体系中至所述微粒体蛋白终浓度为32-96μg/mL，香豆素终浓度为50μM，安非他酮终浓度为25μM，阿莫地喹终浓度为50μM，右美沙芬终浓度为5μM，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后产生的7-羟基香豆素、羟基-安非他酮、N-脱乙基阿莫地喹和右啡烷四种特异代谢产物，并分别计算CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，高效液相色谱条件为：

a)色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，2.1mm×50mm，1.8μm，并配备相应的C₁₈保护柱；

b)流动相由A相和B相组成，所述A相为甲酸乙酸铵水溶液，所述甲酸乙酸铵水溶液中甲酸的体积分数为0.05％，乙酸铵的浓度为1mM，所述B相为甲醇；

c)梯度洗脱条件：0-0.6min，流动相B的比例为0％；0.6-6min，流动相B的比例由0％上升至95％；6-9min，流动相B的比例保持为95％；9-10min，流动相B的比例为由95％降至0％；

d)柱温：40℃；

e)流速：0.3mL/min；

f)自动进样室温度：4℃，进样体积为5μL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱条件为：

a)离子源：电喷雾电离；

b)检测方式：正离子；

c)锥孔电压：3kV；

d)去溶温度：500℃；

e)去溶气体及流速：氩气，646L/h；

f)扫描模式：多反应离子监测；

g)母离子/子离子对：162.9/106.9、256/238、328/255、258/199；

h)孔电压：24V、14V、20V、35V；

i)碰撞电压：21eV、13eV、36eV、28eV；

j)保留时间：3.67±0.01min、3.76±0.01min、2.83±0.01min、3.48±0.01min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育体系包括以下成分：缓冲液和NADPH产生系统。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH＝7.5，浓度为0.1M的Tris缓冲液。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述NADPH产生系统由A液和B液按体积比为5:1组成，所述A液包含如下组分：葡萄糖-6-磷酸20mg/mL、NADP 20mg/mL、氯化镁13.3mg/mL；所述B液按如下方法配制：将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶于5mM柠檬酸钠溶液中至所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的终浓度为40U/mL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述升温为将温度升至37±0.1℃；所述酶促反应的时间为15-25min；所述酶促反应终止通过加入100-250μL甲醇实现。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后所产生的四种特异代谢产物前，还包括将酶促反应终止后的孵育混合物在冰浴中静置10min，之后过孔径为0.22μm的滤膜，再以LC-MS/MS检测。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶活力的计算公式如下：

U_CYP亚酶＝C_产物/(M_产物×C_蛋白)

U_CYP亚酶–CYP亚酶活力，单位nmol/mg蛋白；

C_产物–反应体系中特异代谢产物的浓度，单位ng/mL；

M_产物–特异代谢产物的摩尔质量，单位g/mol；

C_蛋白–反应体系中微粒体蛋白终浓度，单位mg/mL。