[发明专利]测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法

说明书

本发明涉及测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法，属于酶活力检测技术领域，该方法具体包括如下步骤：(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；(2)将步骤(1)中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有四种特异探针底物的孵育体系中，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后产生的四种特异代谢产物，并分别计算CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力。该检测方法准确度、精确度及灵敏度高，稳定性强，可用于一次同时测定蚯蚓体内多个CYP亚酶活力，进而为探索蚯蚓不同CYP亚酶对土壤污染物的响应模式提供了检测方法。

技术领域

本发明属于酶活力检测技术领域，具体涉及测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法。

背景技术

细胞色素P450(CYP)酶是一种含金属的氧化酶，是广泛存在于植物、微生物、哺乳动物的完整膜保守蛋白的超家族酶，参与异源物质代谢、药物合成等重要反应。CYP以血红素卟啉铁为中心，通过非共价键结合的血红素中的铁离子传递电子氧化异源物质，增强异源物质的水溶性，使他们更容易排出体外，从而起到解毒作用。人类CYP2亚族如CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2D6，负责市场上40-90％的药物代谢，是重要的CYP亚族。但不同生物体内CYP亚酶的种类及含量可能迥异，同个生物的不同亚酶的含量也可能差异巨大。

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，利用蚯蚓分子生理生化反应可评价污染物的生态风险。当前，有学者分析蚯蚓CYP1A2、CYP2C9及CYP3A4酶活力后，发现蚯蚓这些CYP亚酶对土壤污染物的响应模式及敏感程度不同，依赖于污染物的化学性质，因此推断它们可作为生物标记物诊断土壤污染状况。那么蚯蚓体内是否存在CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6，它们的酶活力水平及能否作为生物标记物，用于实际评估土壤生态风险，值得进一步实验分析与探索。而可靠稳定的蚯蚓CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力检测方法是基本条件与前提。

目前涉及蚯蚓体内CYP亚酶活力的研究报道，采用的测定方法多为探针底物法，该方法中以某药物作为底物，该底物可被专一的某CYP亚酶催化，利用荧光光度计、紫外分光光度计或高效液相色谱仪-紫外检测器检测相应代谢产物的生成量，通过代谢产物的生成量来反映CYP亚酶的活力。但紫外检测器灵敏度低，荧光光度计与紫外分光光度计无法有效分离探针底物和代谢产物，且单次进样仅能测定单个CYP亚酶活力，不能一次同时测定多个CYP亚酶活力。另外，CYP酶本身是一类血红素酶，血红素的存在能严重干扰荧光光度计或紫外检测器的测定。此外，相比于哺乳动物如人类、大鼠，蚯蚓的生物量小，没有肝脏，其体内的CYP含量非常低，已发表文献中常见报道蚯蚓CYP亚酶检测失败这一结果。

且目前尚无文献报道通量测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法。因此，急需一种可在较短时间内从复杂生物基质中以更高的特异性进行更低水平的通量检测蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；