[发明专利]一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法，其特征在于，方法如下:

1)gRNA的设计：在小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子起始密码子ATG附近设计2个gRNA位点，分别gRNA-1和gRNA-2，所述gRNA-1序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA-2序列如SEQ ID No.2所示；

2)Donor DNA的设计：将人源血管紧张素转换酶hACE2的上游同源臂、人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列、polyA序列和人源血管紧张素转换酶hACE2的下游同源臂连接作为Donor DNA片段；

3)显微注射：将步骤1)获得的2个gRNA、步骤2)获得的Donor DNA、Cas9蛋白及Microinjection buffer混合，注射到mT/mG小鼠受精卵的原核中，得到胚胎；

4)胚胎移植：将步骤3)获得的胚胎继续培养至2-细胞后，再将2-细胞胚胎移植到假孕母鼠的输卵管中，直至仔鼠出生；

5)基因型鉴定：对步骤4） 获得仔鼠的基因型进行鉴定，带有人源血管紧张素转换酶hACE2基因序列的仔鼠即为新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子的序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述上游同源臂序列如SEQID No.11所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.12所示。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，上游同源臂引物-F如SEQ ID No.13所示，上游同源臂引物-R如SEQ ID No.14所示，下游同源臂的引物-F如SEQ ID No.15所示，下游同源臂的引物-R如SEQ ID No.16所示。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述Donor DNA的序列如SEQ IDNo.17所示。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述的混合方法是将gRNA-1、gRNA-2、Donor DNA和Cas蛋白按照5:5:2:25的终浓度比混合。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述的小鼠受精卵在显微注射前经37℃孵育15分钟。

9.权利要求1所述的构建方法获得的新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型在新冠病毒致病机理研究、药物或疫苗研发中的应用。