[发明专利]一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用

说明书

本发明属于基因工程领域，提供了一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用。本发明为了获得一种可用于新冠病毒致病机理、药物及疫苗研发的动物模型，以mT/mG小鼠作为实验动物，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过将3’端带有polyA序列的人的血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列插入到小鼠内源血管紧张素转换酶mACE2起始密码子之前的方法，获得了一种可红‑绿荧光转换的新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型，该模型解决了hACE2随机插入及小鼠内源ACE2蛋白表达的问题，并且能够实现对病毒感染过程的跟踪、定位和检测，可极大方便后续的研究和应用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

动物模型是新冠病毒药物、疫苗研发的关键一环，也是深入开展病毒致病机理等研究必不可少的工具。非人灵长类动物(如猴子)虽然更接近人类，但由于价格高、周期长、操作不便等问题，不适合普遍推广和应用。小鼠作为最常用的实验动物，仍然是动物模型的首选，但由于病毒受体(ACE2)结构与人的存在较大差异，导致小鼠对于新冠病毒不易感，不能直接应用于实验。

与SARS病毒类似，新冠病毒(COVID-19)也是通过人类细胞表面受体蛋白ACE2介导入侵细胞。之前在研究SARS的过程中，国内外已建立了几个表达人源ACE2的小鼠模型，如McCray等(2007)、Tseng等(2007)以及我国协和医科大学(2007)、军事医学科学院(2008)等单位均建立了hACE2小鼠。这些小鼠模型的共同缺陷就是hACE2的随机插入导致整合位点和拷贝数都无法控制，一方面，随机插入可能对小鼠造成潜在的负面影响；另一方面，人源ACE2表达的同时小鼠內源ACE2也同样表达，很可能造成小鼠模型不能很好地再现人类的疾病特征。更为重要的是，这些传统的小鼠模型无法快速、直观反映病毒感染情况，也无法实时研究病毒感染过程。

发明内容

为了解决现有的新冠病毒人源化受体小鼠模型hACE2随机插入及小鼠内源ACE2蛋白表达的问题，本发明提供了一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法，构建策略如图1所示，具体方法如下：

1)gRNA的设计：在小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子起始密码子ATG附近设计2个gRNA位点；

2)Donor DNA的设计：将人源血管紧张素转换酶hACE2的上游同源臂、人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列、polyA序列和人源血管紧张素转换酶hACE2的下游同源臂连接作为Donor DNA片段；

3)显微注射：将步骤1)获得的2个gRNA、步骤2)获得的Donor DNA、Cas9蛋白及Microinjection buffer混合，注射到mT/mG小鼠受精卵的原核中，得到胚胎；

4)胚胎移植：将步骤3)获得的胚胎继续培养至2-细胞后，进行输卵管移植，再将2-细胞胚胎移植到假孕母鼠的输卵管中，由母鼠继续饲养，直至仔鼠出生；

5)基因型鉴定：对步骤4获得仔鼠的基因型进行鉴定，带有人源血管紧张素转换酶hACE2基因序列的仔鼠即为新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型。

在本发明的一个实施例中，所述小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子的序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地限定，步骤1)中的两个gRNA分别为gRNA-1和gRNA-2，所述gRNA-1序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA-2序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地限定，步骤2)中人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地限定，步骤2)中所述上游同源臂序列如SEQ ID No.11所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.12所示。